?????? 我想表達遇到的第一個瓶頸估計就是為什么我的外源片段插到載體里面，PCR 鑒定沒問題，雙酶切也 OK ，可是就是不見表達。一般我們是如何判斷沒有表達呢？大多都是首先進行 SDS-PAGE 。在跑膠的時候一定要設對照，比較嚴謹的電泳對照，應該是： Marker ，標準品陽性對照（如果有，且打算做 Western 的話），以及空白載體（誘導）和重組載體（不誘導） 2 個陰性對照，再加上誘導不同時間的表達結果。 Marker 用于判斷條帶大小，標準品用于判斷 Western 體系包括抗體顯色劑和操作的可靠性，以及精確判斷大小；空白載體（誘導）負對照有助于判斷在非誘導條件下的本底表達；而重組載體（不誘導）負對照則有助于判斷誘導的效果以及排除誘導劑對宿主菌潛在的干擾，或者是區分細菌內源和外源表達產物――偷懶可不是好習慣，會影響結果判斷。注意，接種表達和接種做感受態都類似，一定要用挑單克隆、加足量抗生素、過夜培養的新鮮菌液轉種最好，在篩選壓力下生長旺盛的種子液遠比經過 4 ℃保存的菌液要好得多，也許是因為保存時間長會導致抗生素失效部分細菌丟失質粒或者其他變化。反正就是一種經驗做法。

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跑 SDS-PAGE 的話可以用考馬斯亮蘭染，它靈敏度在 100ng 左右；但是不能跟著做 Western 了。銀染的靈敏度在 0.1 ～ 1 ng ；有錢還可以用 Sypro Red ，靈敏度高還可以繼續做 Western 。

在做過 Western Blot 仍沒有檢測到表達帶，那么就要開始進行下一步的分析了。首先，看看載體的多克隆位點和片斷插入的序列，是否有因為酶切連接而意外引入了轉錄終止信號。有時載體幾經多個實驗人員的周轉，反復插入片斷，或者是粘端相同的不同酶切片斷之間的連接，會意外在啟動子后面帶入終止位點，特別是用到 XbaI 之類的酶要小心。然后要對測序結果進行確定，確定插入的每個堿基都是正確的，沒有意外終止的情況。還有個大家容易忽略的問題：就是要看基因中有沒有細菌不常用的密碼子――如果有，需要考慮換表達菌株。每種菌株都有自己獨特的設計，或者是蛋白酶缺陷，或者是重組酶缺陷，改造的目的都是為了讓質粒在細菌中存在更穩定，表達的產物不易被降解。不同的載體要配合一定的菌株使用，像 pET 系列就一定需要有 T7 RNA 聚合酶片段整合在細菌中的菌株才可用于表達。采用不同調控機制會使用不同的表達菌株，所以換菌株一定要仔細看過載體的調控方式再換。以 Novagen 為例，如果使用 BL21(DE3) 表達不成功的話可以換 Rosetta 系列菌株，它能夠由一種氯霉素抗性的、與 pET 相容的質粒提供 AUA ， AGG ， AGA ， CUA ， CCC 和 GGA 的 tRNA 。所以這類菌株能夠明顯改善大腸桿菌中由于稀有密碼子造成的表達限制。有時不明原因的表達蛋白截短（比預期的分子量要小很多）也可能是由于稀有密碼子造成的。另外一種可能是不嚴謹的本底表達產物抑制。

沒有發現原則性錯誤之后，最簡單、快捷的就是改變一下表達溫度、 IPTG 濃度。低溫、較長時間的表達有利于蛋白穩定、融合表達，低濃度的 IPTG 可以減少化學物質對細胞的損傷。培養基中的葡萄糖可能會抑制表達。有時表達的蛋白可能比預期的有不同，要認真研究電泳結果。如果嘗試改變條件后依然沒有表達，可以試試換不同的培養基。除了 LB 外還有 TB 、 M9 等， Novagen 公司還有特殊的培養基出售補充各種細菌生長所需營養。

如果還是不行，考慮那么就剩下換換載體或者表達系統了。在換過不同載體，不同菌株之后仍是表達不出來的話，筆者的建議是：放棄吧。有些蛋白是用大腸桿菌無法表達的，或許可以嘗試其它的表達系統。畢竟，將構建好的質粒交給細菌后，有些事情是我們不能控制的，未知的。嘗試其他的表達系統未嘗不是一種辦法。不過原核不能表達，轉去做真核，也不保險，這時候試試體外表達，會更省事，因為沒有細胞生長的限制，更容易得到結果，可能只是花費高些，產量低些。能做出結果是第一需要時，這些就不能計較太多。隨后將介紹幾個體外表達系統，歡迎留意。

如果你成功表達出來了，首先要恭喜你，之后你仍然可能遇到各種各樣的問題。這個很正常，科研的道路是曲折的嘛。

Q1 ：蛋白表達出來了，但是跑 SDS-PAGE 時大小不符？

進行 SDS-PAGE 的時候蛋白的凈電荷會影響遷移率。帶電量高的蛋白會結合較少的 SDS ，因此阻礙了蛋白的泳動。富含脯氨酸的蛋白會在 SDS-PAGE 膠中移動得特別慢。如果蛋白的等電點在 5 到 9 之間，并且組成的氨基酸組分沒有明顯的偏好，那么目的蛋白遷移率與預期相差較遠就很有可能不是由于凝膠電泳造成的。我們前面提到過，在很特殊的情況下稀有密碼子的問題也會造成表達產物的截短。應加以考慮。

這個時候最好利用 C 端或者 N 端的標簽進行 Western Blot ，看是否由于蛋白被蛋白酶降解而導致多條目的條帶或者比預期小很多的條帶出現。如果排除以上因素仍是無法找出為何與預期大小相差很遠，你只能苦命地重頭再來。如果蛋白酶過高可以換個缺陷菌株試試。 ???????? Q2 ：蛋白不可溶，怎么辦？

許多外源蛋白在大腸桿菌中表達后都是以包涵體形式存在，包涵體是一種致密、不可溶的顆粒。一般情況下，形成包涵體表達產率都很高，并且容易分離，得到比較純的包含體。包涵體致密的結構有助于防止蛋白酶對它的降解作用，如果毒性較強的蛋白形成包涵體也就不會對細胞產生太大的損傷。如果你表達蛋白的目的是為了作為抗原制備抗體，那么出現包涵體也不算太壞，可以用 PBS 將包涵體懸浮，使用佐劑將溶液乳化后注射進入動物體內進行免疫。

包含體的形成據分析原因之一在于表達量過高，表達產物來不及折疊為活性形式――多數以高表達見長的表達系統都會得到包含體產物。如果融合表達含有標簽，常用的做法是將包涵體用尿素溶解后在變性的情況下進行純化，然后復性。復性是表達下游最折磨人的步驟，以后會逐步介紹。但是，在那之前你應該還要確定一下，你的蛋白真的是不可溶嗎？細胞裂解是否完全呢？利用相差顯微鏡或者染色后對細胞裂解物進行觀察。是否仍可以看到完整的細胞？裂解后的沉淀是否和之前收集細胞沉淀大小相似？裂解后溶液是否看起來澄清？以上任何一種情況出現都可能意味著細胞沒有被徹底裂解而導致裂解上清檢測不到產物。如果形成了包涵體，在比較高倍的（ >400 ×）光鏡下可以觀察到大腸桿菌中有致密的結構。因為包涵體可能會占據細胞一半體積。

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Q3 ：必須要可溶的蛋白，你可以怎么做？

如果你希望得到能行使功能的蛋白，那么就最好還是想辦法使蛋白以可溶形式表達，包涵體復性也是一條十分曲折的道路。避免包涵體形成的方法很多，比如：選用表達量不高的表達系統，選擇有助于可溶性表達的融合表達系統比如 pThio ， pMal 等等，對于 T7 系統來說降低或者減少誘導條件（例如降低 ITPG 濃度減少 T7 聚合酶）從而降低表達速度，使用基本培養基等也有助于可溶性表達。另外一個容易忽視的問題是大腸桿菌內還原性過高會導致二硫鍵不能正確形成，同樣容易導致表達產物不溶，更換菌株例如 Novagen 的 Origami 系列也有助于解決這個問題。將在隨后專門介紹幾種特殊的用途的大腸桿菌菌株，不妨留意。

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一般包涵體可以先使用溫和變性劑（如：低濃度的尿素）和去污劑（如： Triton-X 100 ）將包涵體初步洗滌，之后用 8M 尿素將包涵體溶解。可以通過透析復性、或者是在過柱的時候復性。復性條件每個蛋白都是不一樣的，所以是一條需要摸索前進的道路。

有人嘗試當蛋白掛在柱子上的時候，在還原和氧化的谷胱甘肽存在的情況下用濃度從 6M 到 0M 的鹽酸胍過柱，促使蛋白的折疊。在蛋白重新折疊后用咪唑洗脫。

Q4 ：切除標簽時引入的蛋白酶是否一定要切除？

很多時候我們要用蛋白酶除去加入的標簽（除了 NEB 出有內含肽自動斷裂這種模式就不需要蛋白酶了），在蛋白酶切除標簽后是否一定要去除呢？有人認為蛋白酶與目的蛋白加入的比例是 1:500 甚至更低，蛋白酶是不會影響到下一步操作的，在一些粗放的生化實驗不用去處蛋白酶。嚴謹的后繼實驗需要將蛋白酶除去。很多公司已經開發出帶有標簽的蛋白酶，使得僅通過過親和柱就可以方便的去除蛋白酶和融合標簽，令實驗越來越方便了。

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回到開篇的第一句話，成功的試驗大多都是一樣的，而失敗的試驗就各有各的不幸。想把試驗中出現的所有問題都總結出來是不大可能的。各位在原核表達中遇到什么樣的問題歡迎到我們的 BBS 中提出。

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