默克公司關于HIS*TAG實驗過程中常見問題與解決方法

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1、蛋白無法與Ni-NTA His·Bind樹脂結合

目的蛋白無 HisTag 序列

——測序以確定連接處序列和閱讀框是否正確。檢查是否存在內部翻譯起始位點(若 HisTag 序列構建于目的蛋白N 端)，或翻譯提前終止(若 HisTag 序列構建于目的蛋白C 端)

HisTag 序列空間難以接近

——變性條件下純化蛋白;或將 HisTag 序列構建于目的蛋白另一末端

HisTag 序列已被降解

——檢查穿過組分中有無帶有 HisTag 的片段

結合條件不對

——檢查所有溶液的 pH 值和組成成分尿素的解離常導致 pH 值的變化。應在使用之前測定緩沖液pH 值，迅速投入使用確保體系中沒有鰲合劑和還原劑存在;咪唑的濃度太高也會導致蛋白不能與樹脂結合

目的蛋白在漂洗步驟提前被洗出

——洗脫條件過于嚴格降低咪唑濃度，或增加緩沖液pH 值

HisTag 標簽被部分隱藏/屏蔽

——降低洗脫條件的嚴格程度。變性條件下純化目的蛋白

緩沖液條件不正確

——檢查漂洗緩沖液的 pH 值和組成確保體系中不含鰲合劑及還原劑

2、蛋白在純化過程中形成沉淀

溫度過低

——改為室溫純化

蛋白形成聚合物

——嘗試加入增加溶解度的試劑，如0.1% Triton×-100 或Tween-20，高達10mM β-ME 或1mM THP，高達2MNaCI 或幫助穩定蛋白的因子，如 Mg2+。某些情況下，可能需要在純化過程所有緩沖液中加入這些成分以保持蛋白的可溶性

3、目的蛋白無法洗脫

洗脫條件太溫和(蛋白可能以聚合物或多聚體形式存在)

——以 pH 梯度或咪唑梯度洗脫，確定最佳洗脫條件

蛋白洗脫時在柱中沉淀

——變性條件下進行洗脫。以在離心管中結合、洗脫的小量批次方式進行純化，以避免局部蛋白濃度過高

4、目的蛋白與雜蛋白一起洗脫出來

結合和漂洗緩沖液的條件不夠嚴格

——在結合和漂洗緩沖液中加入10-20mM 咪唑

色譜柱載量相對過大減少

——Ni-NTA His·Bind 樹脂或 Ni-IDA His·Bind 樹脂用量

雜蛋白與目的蛋白結合，共純化下來

——加入10 mM β-ME 或1mM THP 以避免雜蛋白與目的蛋白之間形成二硫鍵，加大漂洗緩沖液的鹽濃度，或增加去污劑濃度，加入乙醇/甘油以破壞蛋白之間的疏水作用

雜蛋白是目的蛋白不完整產物

——檢查是否存在可能的內部翻譯起始位點(若HisTag 序列構建于目的蛋白C 端)，或翻譯提前終止(若 HisTag 序列構建于目的蛋白N 端)避免目的蛋白在純化過程中降解，如保持在4℃進行操作，使用蛋白酶抑制劑等。

5、樹脂變色

Ni 離子流失或被還原

——確保體系中無螯合劑(Ni 離子被螯合掉之后，樹脂變白色)或還原劑(樹脂變棕色)