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  • 實驗方法> 蛋白質技術> 其他技術>Northern雜交實驗指導之一:RNA提取

    Northern雜交實驗指導之一:RNA提取

    關鍵詞: northern 雜交 實驗指導來源: 互聯網

    Northern Blotting技術專題

    方法一、改良異硫氰酸胍提取法

    試劑及其配制

    異硫氰酸胍變性液:

    貯存液-在含484ml 水(經DEPC處理), 17.6ml 0.75mol/L檸檬酸鈉(pH7.0)和26.4ml10%Sarkosyl的溶液中加入250g異硫氰酸胍,加熱至60~65℃并持續攪拌使之充分溶解。貯存液室溫保存備用(不超過3個月)。

    工作液-在每50ml貯存液中加入0.35ml2-ME即配制成工作液。工作液于室溫下保存不超過1個月。工作液各成分的終濃度為:

    4mol/L異硫氰酸胍

    25mol/L檸檬酸鈉pH 7.0

    0.5%(w/v)N-十二烷基肌氨酸(Sarkosyl)

    0.1mol/L巰基乙醇(2-ME)

    其它溶液:

    2mol/L乙酸鈉 (NaAc) 緩沖液 (pH 4.0)

    水飽和酚(pH 3.5)

    49∶1 (v/v) 氯仿/異戊醇

    100%異丙醇

    70%乙醇(用DEPC處理水配制)

    DEPC處理后高壓滅菌水

    試驗程序

    1.取0.5~1g左右新鮮植物 組織置于研缽中,加入液氮,迅速研磨成均勻的粉末。

    2.將粉末全部移入冰上預冷的離心管中,并向其中加入5ml異硫氰酸胍變性液,輕輕搖動離心管使混合均勻。

    3.順序加入2mol/l NaAc 0.5ml、水飽和苯酚5ml、氯仿/異戊醇1ml,每加入一種試劑都輕輕搖動離心管混合均勻,最后將離心管蓋緊,倒轉幾次混合均勻,冰浴15min.。

    4.4℃條件下15000g離心30min.,將上層水相轉移至另一干凈的離心管中,并加入等體積的異丙醇,混勻后置于-20℃冰箱冷凍1h.。

    5.4℃條件下13000g離心25min.,小心去除上清液,沉淀溶于1.5ml異硫酸胍變型液中(體積為第一次變性液的1/3),再加入等體積的異丙醇,混勻后置于-20℃冰箱冷凍1h.。

    6.4℃條件下13000g離心20min.,沉淀用70%乙醇洗一次,晾干后溶于適量體積(50&mu;g/100&mu;l)的DEPC處理水中,檢測后分裝,置于-70℃低溫條件下保存。

    注意事項

    RNA提取 過程中,為了保證所提取的RNA的純度和完整性,其中有兩個方面的問題需要特別控制,一是去除與RNA結合的蛋白質,二避免內外源Rnase對RNA的降解。在RNA的提取中,常采用的蛋白質變性劑有苯酚、氯仿、十二烷基磺酸鈉(SDS)等。為防止外源Rnase的污染,所有試驗用品均需用DEPC處理并高壓滅菌,所有試劑配制均需使用經DEPC處理過的水或滅菌處理。內源RNase的抑制采用異硫氰酸胍等強還原劑。為避免人體污染,所有試驗操作均應帶手套,避免人體接觸所有用品。

    方法二、改良Krapp提取法

    試劑及其配制

    RNA抽提掖:

    母液:4mol 異硫氰酸胍

    20mmol EDTA

    20mmol MES

    pH 7.0

    工作液:取400ml母液加入1.7ml 2-ME貯存在4℃條件下備用。

    RNA重懸液:2mol LiCl

    10mmol NaAc

    調整終體積為250ml,pH 5.2,滅菌后貯存在4℃條件下備用。

    試驗程序

    1. 取新鮮植物材料0.5~1g,冷凍干燥。如果必要可加入0.2g砂一起研磨,然后加入 10ml RNA抽提掖充分混勻。

    2.4℃條件下8000rpm離心10min.,將上層水相轉移至一干凈離心管中,加入等體積的酚/氯仿抽提掖,在4℃條件下8000rpm離心10min.。

    3.上清液轉移至一干凈離心管中,再用10ml氯仿洗上清液1次(加入10ml氯仿充分混勻后,在4℃條件下8000rpm離心10min.)。

    4.小心將上清液轉移至另一干凈離心管中,加入1/10 vol 3mol NaAc和2 vol冷無水乙醇,在-80℃條件下沉淀2小時。

    5.在4℃條件下8500rpm離心30min.,小心棄去上清液,沉淀重懸于RNA重懸液中,置于4℃條件下1小時。

    6.4℃條件下8500rpm離心10min.,棄去上清液,沉淀溶于適當體積的DEOC處理水中。檢測后分裝,置于-70℃條件下保存。

    推薦方法

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