一、蛋白樣品的制備與定量（提取好的蛋白是成功的一半）（1）提細胞蛋白

① 消化或刮下細胞至 1.5 的 EP 管中，標記，10000r 離心 2 min，PBS 洗 2-3 遍。

② 盡量吸去 EP 管中 PBS，加適量 RIPA 裂解液（RIPA 裂解液+蛋白酶、磷酸酶、PMSF 三聯裝）。

③ 冰上裂解 30 min~1 h，開 4°離心機。

④ 4°離心 11000r，20 min。

⑤ 取上清，測蛋白濃度，加蛋白上清的四分之一體積 5x 上樣 loading buffer，煮沸（95℃ 加熱 5 min），分裝。

（2）提組織蛋白

① 研缽中倒入液氮，加入組織塊，研磨，加液氮，藥匙刮。

② 刮下后放入 1.5 ml 的 EP 管，加適量裂解液，吹打。

③ 冰上放置 1 h，期間，每隔 10~15 min 吹打一次或者用震蕩儀震蕩 2 min。

④ 4°離心 11000r，20 min。

⑤ 取上清，測蛋白濃度，加 1/4 體積 5x loading buffer，煮沸（95℃ 加熱 5 min），分裝。

（3）測蛋白濃度（BCA 法）

① 八個標準孔，按說明書先加 PBS，再加標準蛋白液

② 目的孔，每孔加 18ulPBS+2ul 目的蛋白

③ 按說明書配 BCA 工作液，每孔加 200ul

④ 37°放置半小時后測濃度

（4）計算上樣量，設計上樣順序

上樣體積：上樣量/濃度 x 5/4

上樣順序：無處理，對照，處理；體積最好不要相差太大

經驗總結：

如何提高蛋白濃度：首先當然是多培養點細胞，多提供點組織啦，其次可以少加點裂解液，裂解時間長點，盡量裂解充分。

如何處理蛋白濃度低的問題：實驗過程中發現蛋白的濃度太低，如果上樣的話，體積太大，甚至電泳孔都裝不下，舉例：假設我需要上樣 40ul 才能達到 20ug，那么顯然按照常規的方法，10 孔的梳子只能加 25ul 左右，我們此時可以取 40ul 蛋白入 EP 管中，放置于 PCR 儀器，變性溫度濃縮蛋白體積，這樣不斷濃縮之后促使 EP 管中蛋白的水分降低，蛋白量依舊是 20ug。

如何保證對照組和實驗組蛋白濃度大概是一致的：種植細胞的時候計數、鋪板，使鋪下去的細胞數接近。

二、電泳

1、 清洗玻璃板，去離子水沖，風干或烤干。這步清洗很重要。

2、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒配膠。先配下膠（分離膠），一般兩塊板配 10 ml 的 10% 的膠（20~80kDa 通用），混勻后灌膠，立即用正丁醇或水封，待凝固后倒出正丁醇或者水，用濾紙吸干；

3、 配上膠（積層膠），一般兩塊板配 4 ml 的 5% 的膠，混勻后灌膠，插板, 待凝固。

4、將玻璃板裝好放入電泳槽中，加電泳液，輕輕拔梳。這步要注意必須要兩塊板一起。

5、上樣

6、 連接電源，一定要注意紅對紅，黑對黑，定電壓和時間，上膠（90v，約 40 min，maker 分出條帶），換壓，下膠（120v，2 h）。（不要讓溴酚藍跑出去）

經驗總結：

膠的濃度根據你所需要跑的蛋白的分子量大小決定，

想要條帶跑的好看點，最好把上膠稍微配高一點。

APS 最好現配先用，配制好后放 4 度避光保存，最多保存一周。

膠最好現配現用，如果需要保存最好用濕潤的保鮮膜包好

TEMED 可以催化過硫酸銨產生自由基，所以要注意是否過期失效，主要避光保存。

三、轉膜（整個 WB 過程中最重要的環節）

① 跑到溴酚藍距離靠近最下緣時，要提前準備半干法轉膜液。

② 在電轉液中剝膠，裁膠，剪膜，膜活化。

③ 「三明治」黑板~海綿~三層濾紙~膠~膜（正面朝下，分清左右，與膠對應）~3 層濾紙~海綿~白板，夾緊后放入電轉槽中。（海綿，濾紙，膜需浸潤透，過程中不能干，趕走氣泡）。

④ 連接電源，一定要注意紅對紅，黑對黑，定電流和時間。

經驗總結：

溴酚藍跑到最終的距離是根據你所需要切的分子量決定的。

濾紙和 PVDF 膜的裁剪必須要整齊，干凈，標記清晰。

PVDF 膜型號的選擇要正確。如正常的 30~170kDa 的分子一般需要孔徑 0.45 mm 的膜就足夠了。太小的則需要選擇孔徑為 0.22 mm 的膜。

關于轉膜是否要加 SDS 的問題。SDS 帶負電，加 SDS 一般是針對那些分子大的 WB，加入 SDS 可以增加分子導電性，這樣更利于轉膜。

關于轉膜電流，分子是否能夠轉過去和轉膜時間沒有必要關系，而更在于轉膜電流的大小。舉個例子，200kDa 的分子量，你用 90mAh 就算轉一年都轉不過去。

四、免疫印跡

① 膜處理（甲醇 1 min，風干（放濾紙上），甲醇 1 min，水 1 min）。

② 封閉（Western 封閉液）1 h 配搖床。

③ 加一抗，牛奶稀釋所需濃度參考抗體說明書，根據膜的大小稀釋一抗，4°過夜。

④ 室溫孵育 20 min。

⑤ 0.1%TBST 洗 10 min x 3 次配搖床（0.1%TBST：tris12.1 g，NaCl87.66 g，HCl 至 PH7.6 后定容至 1L 后，加入 1 ml 的 TWEEN20）。

⑥ 加二抗，牛奶稀釋（根據說明書上進行稀釋），1 h 配搖床

⑦ 0.1%TBST 洗 10 min x 3 次配搖床。

⑧ 發光（顯影定影試劑盒）（A 液 B 液等體積混合，孵膜 1 min，正面朝上放入儀器內發光）。

經驗總結：

封閉液的選取具體得看抗體說明書，有的抗體是明確要求只能用 BSA，而且封閉液濃度的選擇也是具體得看抗體的要求，但是一般情況 5%BSA 的效果會比 5% 牛奶要好。

信號通路一般都是用 5%BSA 封閉。且洗膜的時候用快速搖床 5 min/次 3 次就可以了。

如果你想省時間，一抗可以放在 37℃1~2 hour，但是一定要封好，以免溫度太高而導致抗體干了出現假陽性。二抗可以 37℃ 半個小時。

發光液的選取，如果是一般的抗體，建議用一般的發光液效果會好一點，背景會比較干凈。但是一些難發出來的一般建議用 ECL 超敏化學發光試劑盒。

Western Blot 做順的時候很簡單，要不順的時候會被它折磨死。所以內參的選擇顯的尤為重要。

接下來講講怎么做好對照組實驗，即怎么選擇內參。

1. 內參的重要性：

內參即是內部參照 (Internal Control)，內參一般是指由管家基因編碼表達的蛋白 (Housekeeping Proteins)，它們在各組織和細胞中的表達相對比較恒定，在檢測蛋白的表達水平變化時常用它來做參照物。

在 Western Blot 實驗中，除了需要進行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上樣電泳、轉膜、靶蛋白抗體孵育、顯色等步驟以外，還需要進行內參的檢測，以校正蛋白質定量、上樣過程中存在的實驗誤差，保證實驗結果的準確性與嚴謹性。

2. 如何選擇合適的細胞核內參抗體？

常用的總蛋白內參即 GAPDH 和細胞骨架蛋白β-Actin 或β-Tubulin 等；

對于一些植物的樣本，則需要特別的植物 Actin 蛋白作為內參；

當實驗樣品中只是核蛋白，而不是細胞總蛋白提取液時，可以用：核纖層蛋白 B 即 Lamin B 為核內參抗體。

另外，小伙伴們還需要根據目的蛋白的大小選擇合適的核內參，推薦內參要與檢測的目的蛋白的分子量最好相差 5KD 以上，因此你需要根據你目的檢測蛋白的分子量來選擇合適的內參。

3．目的蛋白表達部位：

就一般的蛋白檢測來說，Actin、β-actin、β-Tubulin 抗體等就可以了，而針對于核蛋白的定量，特別是樣本蛋白就是核蛋白時，選擇恰當的核蛋白內參則更能體現內部參照的價值。常用的核內參抗體有 Lamin A、Lamin B、Histone H3，除此之外，其而對于膜蛋白檢測，常用的內參抗體為 Na,K ATPase。對于線粒體蛋白的檢測，常用 VDAC1 和 COX IV 作為內參抗體。

以上幾條原則只是針對通常情況，但是需要注意的問題是——內參的選擇需要考慮實際的實驗環境，比如某些細胞中，由于組織缺氧、糖尿病等因素會導致 GAPDH 的表達增高，不適合做內參。

比如在涉及細胞增殖相關試驗中，c-Jun 由于自身表達變化就不適合做內參; 而在凋亡實驗時，TBP、Lamin 等也不適合作為內參。因此設計實驗方案的時候應該考慮這些因素并查詢相應文獻，在實驗過程中也應該注意如果內參表達出現異常，應考慮這方面因素。