瓊脂糖凝膠電泳法分離LDH同工酶及血清LDH總活力的測定

一、目的：

1.學習瓊脂糖聚膠電泳的原理和方法；

2.學習酶專一性染色原理及其應用；

3.掌握分離LDH同工酶的方法；

4.學習測定血清LDH總活力的原理與方法。

二、原理：

能催化同一反應而蛋白質結構不同的酶，稱為同工酶。同工酶的蛋白結構既然有差別，它們的理化性質也就有所差異。因此可用電泳或其他方法將它們分離開來。例如乳酸脫氫酶（LDH）同工酶，它們都能催化乳酸脫氫產生丙酮酸，但經電泳法分離后，就有5個同工酶區帶。

由于同工酶在不同組織、器官中的分布不同，即具有組織器官特異性。因此已利用同工酶的酶譜作臨床診斷的依據，也被利用于生物分類及遺傳育種等工作中。

本實驗是用瓊脂糖凝膠電泳法分離人血清乳酸脫氫酶五個同工酶（LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5）。血清乳酸脫氫酶的輔酶是NAD 。當它催化乳酸脫氫時，NAD 即被還原成NADH·H 。

如果還有氧化型吩嗪二甲酯硫酸鹽（N-methyl-phen-azo-nium-metho sulfate，簡稱PMS）和硝基藍四唑（氮藍四唑nitroblue tetrazolium，簡稱NBT）存在，則發生如下反應：

當LDH同工酶區帶在瓊脂糖凝膠板上分開后，給予NAD 、底物（乳酸）、PMS和NBT，同工酶區帶即呈藍紫色。乳酸脫氫酶在輔酶I的遞氫作用下，使乳酸脫氫而生成丙酮酸。

LDH分子量約14萬。草酸、乙二胺四乙酸對本酶有抑制作用，所以血漿不適宜測定乳酸脫氫酶活力。此外，硼酸、汞離子、對氯汞苯甲酸以及過量的丙酮酸、乳酸也有抑制作用。

乳酸脫氫酶催化反應是碳水化合物代謝中無氧糖酵解的最終反應，廣泛存在于人體各種組織中，按新鮮重量計算，乳酸脫氫酶活力依下列順序降低：腎臟＞心肌、骨胳肌＞胰＞脾＞肝＞肺。血清中含量很低，紅細胞中含量較血清約高100倍，故測定時應避免溶血。如不能及時測定，血清應及早和血塊分離，避免紅細胞中乳酸脫氫酶逸入血清中。

乳酸脫氫酶測定的方法很多，根據酶作用的反應可分為二大類：一類利用順向反應以乳酸為基質；另一類利用逆向反應，以丙酮酸為基質。根據測定方法不同又可分為紫外分光光度法和可見分光光度法。紫外分光光度法需用紫外分光光度計測定反應中輔酶I量的變化。可見分光光度法利用2，4—二硝基苯肼和丙酮酸作用，生成丙酮酸二硝基苯腙，在堿性溶液中呈棕色。目前較多使用以乳酸為基質的方法，此法所需的氧化型輔酶I較穩定，不似以丙酮酸為基質的方法需用的還原型輔酶I很不穩定（在-20℃也不能長期保存）。氧化型輔酶I價格也較低。此外，乳酸鈉基質液也比丙酮酸基質穩定，室溫中可放1個月。

近來有人利用順向反應形成的還原型輔酶I可以還原某些染料如2，6—二氯酚-吲哚酚（2，6-dichlorophenol-indophenol）、氯化2-（4-碘苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-苯基四唑（INT）建立了另外一種類型呈色反應，并以吩嗪二甲酯硫酸鹽（PMS）或黃遞酶（diapho-rase）作為還原型輔酶I和染料之間的遞氫體。此法快速，操作簡單，重復性較好。乳酸脫氫酶同工酶顯色一般也多利用此類還原四唑藍方法。

三、器材及試劑：

1.器材：

①巴比妥-HCl緩沖液（pH8.4，0.1mol·L-1）：溶17.0g巴比妥鈉于600ml水，加入1mol·L-1 HCl溶液23.5ml，再加蒸餾水至1000ml。

②0.5mol·L-1乳酸鈉溶液：稱取5.6g乳酸鈉，溶于蒸餾水并稀釋至100ml。

③0.001mol·L-1 EDTA·2Na（乙二胺四乙酸鈉鹽）溶液：稱取EDTA·2Na·H2O372mg，溶于蒸餾水并稀釋至100ml。

④0.5%瓊脂糖凝膠：溶50mg瓊脂糖于5ml巴比妥-HCl緩沖液（pH8.4，0.1mol/L），加蒸餾水5ml，待瓊脂糖溶化后，再加0.001mol·L-1 EDTA·2Na溶液0.2ml，冰箱保存備用。

⑤0.8—0.9%瓊脂糖染色膠：溶80—90mg瓊脂糖于5ml巴比妥- HCl緩沖液（pH8.4，0.1mol·L-1），加蒸餾水5ml，待瓊脂糖溶化后，再加0.001mol/L EDTA·Na2溶液0.2ml，冰箱保存備用。

⑥顯色液：現用現配。溶50mgNBT(硝基藍四唑)于20ml蒸餾水（25ml棕色容量瓶），溶解后，加入NAD125mg及PMS（吩嗪二甲酯硫酸鹽）12.5mg，再加蒸餾水至25ml。該溶液應避光低溫保存，一周內有效。如溶液呈綠色，即失效。

⑦2%醋酸緩沖液：2ml醋酸（99.5%）加蒸餾水98ml。

⑧電泳用緩沖液（pH8.6，0.075mol·L-1）；巴比妥鈉15.45g、巴比妥2.76g溶于蒸餾水，稀釋至1000ml。

⑨0.1mol·L-1甘氨酸溶液：稱取甘氨酸7.505g，氯化鈉5.85g，用蒸餾水溶解并稀釋至1000ml。

⑩乳酸鈉緩沖基質液(pH10.0)：在乳酸鈉溶液（65~70%）10ml中加入0.1mol·L-1甘氨酸溶液125ml、0.1mol·L-1氫氧化鈉75ml，混和。

四、操作步驟：

（一）瓊脂糖凝膠電泳法分離LDH同工酶。

1.瓊脂糖凝膠板的制備和電泳：將0.5%瓊脂糖凝膠水浴加溫熔化。取2ml熔化的凝膠液平澆于一潔凈的載玻片上（載玻片放在水平臺上，載玻片的大小為7.5×2.5cm）。

在凝膠半凝固時，用一小鐵棒在1/3處放下，待膠凝固后，用磁鐵吸出小鐵棒，用濾紙片仔細吸去小槽內液體，此小槽為點樣槽（圖18-1）

用微量注射器向小槽內加入新鮮血清15—20μl。將凝膠板放在電泳槽內，兩端各以浸有電泳緩沖液的濾紙或紗布作鹽橋，點樣端靠近陰極。電泳40—60分鐘，電壓約100伏。

2.顯色：約于電泳終止前10分鐘，將0.8—0.9%瓊脂糖染色膠在水浴中熔化。取此熔化的凝膠0.67ml與顯色液0.53ml及0.5mol·L-1乳酸鈉溶液0.2ml混勻，立即澆在電泳完畢的凝膠板上，37℃避光保溫1小時，即顯示出五條深淺不等的藍紫色區帶。最靠近陽極端的區帶是LDH1，依次為LDH2、LDH3和LDH4，LDH5則移向陰極端。

3.固定與干燥：將顯色后的凝膠板浸于2%醋酸溶液中，2小時后取出，用一干凈濾紙覆蓋凝膠板上，50℃烘1.5—2小時，烘干后，取下濾紙，背景即透明。

如需定量，可用凝膠成像分析系統或光密度計測定各區帶。

（二）LDH活力測定

1.標準曲線繪制見表18-1。

單位定義 以標本100ml即100ml原血清在37℃作用15分鐘產生丙酮酸分子1個微摩爾為1個單位。

五、結果與討論：

1.用凝膠成像系統對LDH同工酶各組分進行定量。

2.計算出血清LDH總活力：

①繪制出標準曲線

②按下述公式計算LDH總活力

3.總結出來實驗中電泳分離LDH操作的關鍵步驟。

4.寫出酶活力測定中的注意事項。