摘要： DNA甲基化是表觀遺傳學(Epigenetics)的重要組成部分，在維持正常細胞功能、遺傳印記、胚胎發育以及人類腫瘤發生中起著重要作用，是目前新的研究熱點之一。隨著對甲基化研究的不斷深入，各種各樣甲基化檢測方法被開發出來以滿足不同類型研究的要求。這些方法概括起來可分為三類：基因組整體水平的甲基化檢測、基因特異位點甲基化的檢測和新甲基化位點的尋找。本篇將主要介紹目前存在的大部分DNA甲基化研究方法，并對其相關特性進行了簡要分析與總結。

　　關鍵詞：表觀遺傳學；DNA甲基化；甲基化研究方法

　　早在1942年,C.H.Waddington首次提出表觀遺傳學(epigenetics)的概念,并指出表觀遺傳與遺傳是相對的,它主要研究基因型和表型的關系。幾十年后,霍利迪(R. Holiday)針對表觀遺傳學提出了更新的系統性論斷，也就是人們現在比較統一的認識[1]，即在不改變基因組序列的前提下，通過DNA和組蛋白的修飾來調控基因表達，這種修飾以DNA甲基化最為常見。

　　繼人類基因組計劃結束后，2003年人類表觀基因組協會(Human Epigenome Consortium, HEC)宣布開始投資和實施人類表觀基因組計劃(HEP)。其主要任務是繪制出人類基因組中甲基化可變位點圖譜，即不同組織與疾病狀態下，5-甲基胞嘧啶出現及其分布頻率的圖譜，以指導和系統地研究DNA甲基化在人類表觀遺傳、胚胎發育、基因印記、等位基因失活及腫瘤發生中的重要作用[2]。DNA甲基化的研究，逐漸成為新的研究熱點。隨著對甲基化研究的不斷深入，各種各樣甲基化檢測方法被開發出來以滿足不同類型研究的要求。讓我們一一介紹現有的大部分DNA甲基化研究方法，并對其相關特性進行簡要分析與總結。

　　1導言

　　1.1 DNA甲基化及CpG島

　　DNA甲基化是最早發現的基因表觀修飾方式之一,可能存在于所有高等生物中。DNA甲基化能關閉某些基因的活性，去甲基化則誘導了基因的重新活化和表達。甲基化的主要形式有5-甲基胞嘧啶,N6-甲基腺嘌呤和7-甲基鳥嘌呤。原核生物中CCA/TGG和GATC常被甲基化，而真核生物中甲基化僅發生于胞嘧啶。

　　DNA的甲基化是在DNA甲基化轉移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5'端的胞嘧啶轉變為5'甲基胞嘧啶。這種DNA修飾方式并沒有改變基因序列，但是它調控了基因的表達[3]。脊椎動物基因的甲基化狀態有三種：持續的低甲基化狀態,如管家基因；去甲基化狀態,如發育階段中的一些基因；高度甲基化狀態,如女性的一條失活的X染色體[4]。

　　哺乳動物中，CpG序列在基因組中出現的頻率僅有1%，遠低于基因組中的其它雙核苷酸序列。但在基因組的某些區域中，CpG序列密度很高，可以達均值的5倍以上，成為鳥嘌呤和胞嘧啶的富集區，形成所謂的CpG島[5]。通常，CpG島大約含有500多個堿基。

　　在哺乳動物基因組中約有4萬個CpG島，而且只有CpG島的胞嘧啶能夠被甲基化[6]，CpG島通常位于基因的啟動子區或是第一個外顯子區[7]。健康人基因組中，CpG島中的CpG位點通常是處于非甲基化狀態，而在CpG島外的CpG位點則通常是甲基化的。這種甲基化的形式在細胞分裂的過程中能夠穩定的保留[8]。當腫瘤發生時，抑癌基因CpG島以外的CpG序列非甲基化程度增加，而CpG島中的CpG則呈高度甲基化狀態，以致于染色體螺旋程度增加及抑癌基因表達的丟失[9]。

　　1.2 DNA甲基化的生物學作用

　　1.2.1 DNA甲基化與遺傳印記、胚胎發育

　　DNA甲基化在維持正常細胞功能、遺傳印記、胚胎發育過程中起著極其重要的作用。研究表明胚胎的正常發育得益于基因組DNA適當的甲基化。

　　例如：缺少任何一種甲基轉移酶對小鼠胚胎的發育都是致死性的（Li等1992年和Okano等1999年）[3]。此外，等位基因的抑制(allelic repression)被印記控制區(imprinting control regions, ICRs)所調控,該區域在雙親中的一個等位基因是甲基化的[4]。印記基因的異常表達可以引發伴有突變和表型缺陷的多種人類疾病。如：臍疝-巨舌-巨大發育綜合征(Beckwith-Wiedemann Syndrome, BWS)和Prader-Willi/Angelman綜合征等[10]。

　　1.2.2 DNA甲基化與腫瘤

　　甲基化狀態的改變是引起腫瘤的一個重要因素,這種變化包括基因組整體甲基化水平降低和CpG島局部甲基化水平的異常升高,從而導致基因組的不穩定(如染色體的不穩定、可移動遺傳因子的激活、原癌基因的表達)[4]和抑癌基因的不表達。如果抑癌基因中有活性的等位基因失活，則發生癌癥的機率提高,例如：胰島素樣生長因子-2（IGF-2）基因印記丟失導致多種腫瘤,如Wilm‘s瘤[11]。

　　目前腫瘤甲基化的研究主要集中在抑癌基因。這是因為人們發現腫瘤的發生可能與抑癌基因啟動子區的CpG島甲基化造成抑癌基因關閉有關[12]。由于CpG島的局部高度甲基化早于細胞的惡性增生，因此甲基化的診斷可以用于腫瘤發生的早期預測[13]，而且全基因組的低甲基化也隨著腫瘤發生而出現，并且其隨著腫瘤惡性度的增加而顯著[14] ,因此甲基化的檢測可用于腫瘤的分級。

　　Shinichi Toyooka描述了腫瘤發生與異常甲基化的關系：被SV40 (Simian Virus 40)感染的人間皮細胞，其端粒酶活性上調，Notch-1基因表達增加，腫瘤相關基因（包括抑癌基因RASSF1A）的啟動子區發生異常甲基化[15]。Cui等發現部分結腸癌患者的正常腸粘液腺細胞的IGF-2基因印記丟失[16]。Uhlmann等發現不同病理類型及不同惡性程度的神經膠質瘤細胞的7種腫瘤標志基因存在著不同程度的甲基化 [17]。因此，甲基化的研究，為腫瘤的早期預測、分類、分級及預后評估提供了新的依據 。

　　1.3 DNA甲基化的研究方法

　　近15年來，人們越來越認識到DNA甲基化研究的重要性，開發出一系列檢測DNA的方法。根據研究目的這些方法分為：基因組整體水平的甲基化檢測，特異位點甲基化的檢測和新甲基化位點的尋找。根據研究所用處理方法不同可以分為：基于PCR的甲基化分析方法；基于限制性內切酶的甲基化分析方法；基于重亞硫酸鹽的甲基化分析方法和柱層法等。Christina Dahl和Per Guldberg[3]歸納總結了主要的甲基化分析方法及相關特性，在此基礎上我們略加以補充。

　　2 甲基化研究方法學回顧

　　2.1 基因組整體水平甲基化分析

　　2.1.1 高效液相色譜柱（HPLC）及相關方法

　　HPLC是一種比較傳統的方法，能夠定量測定基因組整體水平DNA甲基化水平。它由Kuo等1980年[18]首次報道。過程是將DNA樣品先經鹽酸或氫氟酸水解成堿基，水解產物通過色譜柱，結果與標準品比較，用紫外光測定吸收峰值及其量，計算5mC/(5mC+5C)的積分面積就得到基因組整體的甲基化水平。這是一種檢測DNA甲基化的標準方法。但它需要較精密的儀器。Fraga等2002年[19]運用高效毛細管電泳法(HPCE)處理DNA水解產物，以確定5mC的水平。與HPLC相比，HPCE更加簡便、快速、經濟。HPLC及HPCE測定基因組整體DNA甲基化水平的敏感性均較高。Oefner等1992年[20]提出變性高效液相色譜法（DHPLC）用于分析單核苷酸和DNA分子。鄧大君等2001[21]將其改進與PCR聯用建立了一種檢測甲基化程度的DHPLC分析方法。將重亞硫酸鹽處理后的產物進行差異性擴增，由于原甲基化的在重亞硫酸鹽處理時仍被保留為胞嘧啶，因此原甲基化的在PCR擴增時，其變性溫度也相應上升，使PCR產物在色譜柱中保留的時間明顯延長，這樣就可以測定出PCR產物中甲基化的情況。

　　這種方法的最明顯優點是：可用于高通量混合樣本檢測，能夠明確顯示目的片段中所有CpG位點甲基化的情況，但不能對甲基化的CpG位點進行定位。

　　2.1.2 SssI 甲基轉移酶法[22]

　　SssI甲基轉移酶能夠催化DNA的CpG位點發生甲基化。3H-S-腺苷甲硫氨酸(3H-SAM)在SssI甲基轉移酶催化作用使基因組DNA的CpG位點發生甲基化。通過測定剩余的放射性標記的SAM即可得到原基因組整體甲基化水平，即測到的放射性強度與所測DNA甲基化水平成反比。這種方法的缺點是所使用的SssI甲基轉移酶不穩定，致結果不夠精確。

　　2.1.3 免疫化學法[23]

　　這種方法是基于單克隆抗體能夠與5mC發生特異性反應。應用熒光素標記抗體使之與預先已固定在DEAE膜上的樣品DNA特異性結合，對DEAE膜上的熒光素進行掃描得到5mC的水平，其熒光素強度與5mC水平成正比。Oakeley等1997年[23]報道了這種方法。這種方法需要精密的儀器。

　　2.1.4 氯乙醛法

　　Oakeley等1999年[24]首先描述了這種使用氯乙醛和熒光標記的方法。首先，將DNA經重亞硫酸鹽處理使未甲基化的胞嘧啶全部轉變為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變（Frommer等1992年）[25]，然后經過銀或色譜柱去除DNA鏈上的嘌呤，再將樣品與氯乙醛共同孵育，這樣5mC就轉變為帶有強熒光的乙烯胞嘧啶，熒光的強度與原5mC的水平成正比。這種方法可以直接測定基因組整體5mC水平。其優點是所用試劑價格低廉且穩定性好，避免了放射性污染，但缺點是費時費力，而且氯乙醛是一種有毒的物質。

　　2.2 特異性位點的DNA甲基化的檢測

　　2.2.1 甲基化敏感性限制性內切酶（methylation-sensitive restriction Endonuclease，MS-RE）-PCR/Southern法

　　這種方法利用甲基化敏感性限制性內切酶對甲基化區的不切割的特性，將DNA消化為不同大小的片段后再進行分析。常使用的甲基化敏感的限制性內切酶有HpaⅡ-MspⅠ(識別序列CCGG)和SmaⅠ-Xmal(CCCGGG)等。由于后者識別的堿基數相對較多，其堿基序列在體內出現的概率相對較低，所以以前者即HpaⅡ-MspⅠ更常用。其中HpaⅡ和MspⅠ均能識別CCGG序列，然而當序列中的胞嘧啶發生甲基化時，HpaⅡ不切割，利用HpaⅡ-MspⅠ的這種屬性處理DNA，隨后進行Southern或PCR擴增分離產物，明確甲基化狀態[12][26]。

　　這是一種經典的甲基化研究方法，其優點是：相對簡單,成本低廉，甲基化位點明確,實驗結果易解釋；缺點是：1.由于CG不僅僅限于CCGG序列中，因此非該序列中的CG將被忽略；2.只有檢測與轉錄相關的關鍵性位點的甲基化狀態時,該檢測方法的結果才有意義；3.相對而言，Southern方法較復雜，且需要樣本的量大；4.存在著酶不完全消化引起的假陽性的問題；5.不適用于混合樣本。

　　2.2.2 直接測序法

　　直接測序是由Frommer等[25]提出的研究DNA甲基化方法。過程是：重亞硫酸鹽使DNA中未發生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉變成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不變（見圖1），行PCR擴增所需片段,則尿嘧啶全部轉化成胸腺嘧啶，最后,對PCR產物進行測序并且與未經處理的序列比較,判斷是否CpG位點發生甲基化。此方法是一種可靠性及精確度很高的方法，能明確目的片段中每一個CpG位點的甲基化狀態，但需要大量的克隆測序,過程較為繁瑣、昂貴[27]。

　　圖1：重亞硫酸鹽處理過程示意圖。DNA經重亞硫酸鹽處理后，甲基化的胞嘧啶不變，未甲基化的胞嘧啶轉變為尿嘧啶

　　2.2.3 甲基化特異性的PCR（methylation-specific PCR, MS-PCR）

　　Herman等1996年[28]在使用重亞硫酸鹽處理的基礎上新建的一種方法。它將DNA先用重亞硫酸鹽處理，這樣未甲基化的胞嘧啶轉變為尿嘧啶，而甲基化的不變，隨后行引物特異性的PCR。MS-PCR中設計兩對引物，并要求：1.引物末端均設計至檢測位點結束；2.兩對引物分別只能與重亞硫酸鹽處理后的序列互補配對，即一對結合處理后的甲基化DNA鏈，另一對結合處理后的非甲基化DNA鏈。檢測MSP擴增產物，如果用針對處理后甲基化DNA鏈的引物能擴增出片段，則說明該被檢測的位點存在甲基化；若用針對處理后的非甲基化DNA鏈的引物擴增出片段，則說明被檢測的位點不存在甲基化（見圖2）[26][27]。

　　圖2：甲基特異性的PCR擴增（MS-PCR）示意圖。DNA經重亞硫酸鹽處理后，以處理后的產物作為模板，加入甲基化特異性的引物（primerⅠ）或非甲基化的引物（primerⅡ），進行特異性的擴增（如圖所示），只有結合完全的甲基化或非甲基化特異性引物的片段才能擴增出產物。

　　這種方法的優點是：1.避免了使用限制性內切酶及其后續相關問題；2.敏感性高；可用于石蠟包埋樣本[12]；缺點是：1.要預先知道待測片段DNA的序列；2.引物設計至關重要；3.若待測DNA中5-甲基胞嘧啶分布極不均衡，則檢測時較為復雜；4.這種方法只能作定性研究，即只能明確是否存在甲基化；若要求定量，則需用其他的方法進行進一步檢測；5.存在重亞硫酸鹽處理不完全導致的假陽性。

　　2.2.4 甲基化敏感性單核苷酸引物延伸（methylation-sensitive single nucleotide primer extension，Ms-SnuPE）

　　Gonzalgo and Jones 1997年提出了結合重亞硫酸鹽處理和單核苷酸引物延伸（Kuppuswamy等1991年提出[29]）的Ms-SnuPE方法[30]，用于定量檢測已知序列中特異位點的甲基化水平。過程是：先將研究序列用重亞硫酸鹽處理，未甲基化的胞嘧啶全部轉化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變。進行PCR擴增，然后取等量擴增產物置于2管中，分別作為Ms-SnuPE單核苷酸引物延伸的模板。設計用于Ms-SnuPE延伸的引物的3’端緊鄰待測堿基。同時于2個反應體系中加入等量的Taq酶、引物、同位素標記的dCTP或dTTP。這樣，如果待測位點被甲基化，則同位素標記的dCTP會在反應延伸時連于引物末端；若是未被甲基化，則標記的dTTP參與反應。末端延伸產物經電泳分離和放射活性測定后可得出C/T值，即為甲基化與非甲基化的比值，從而分析得到待測片段中CpG位點甲基化情況[5][29]（見圖3）。同理也可以用dGTP或dATP。而且，若需研究一條鏈上不同位點CpG甲基化情況，可通過設計不同的引物在同一反應中完成[12]。

　　圖3: 甲基化敏感性單核苷酸引物延伸（Ms-SnuPE）示意圖。DNA經重亞硫酸鹽處理后，以PCR擴增后得到產物作為Ms-SnuPE延伸的模板，于反應體系中入設計好的引物和同位素標記的dCTP或dTTP進行甲基化特異的單核苷酸引物延伸，隨后，電泳分離、測定同位素放射活性，確定甲基化水平。

　　這種方法的優點：1.可以了解特異位點甲基化情況且不受內切酶的限制；2.通過設計的不同引物在同一延伸反應情況可以了解不同位點CpG甲基化的狀況；3.可以檢測出樣本序列中分布不均勻的甲基化位點；4.是一種能夠用于定量檢測甲基化水平的方法；5.僅需少量的DNA樣本，可以用于石蠟包埋樣本的測定。缺點是：1.實驗步驟略復雜，若要檢測多個位點時則需設計多個引物[5]；2.存在放射性污染及重亞硫酸鹽處理不完全的問題。

　　2.2.5 結合重亞硫酸鹽的限制性內切酶法（combined bisulfite restriction analysis，COBRA）

　　Xiong and Peter報道了COBRA[31]甲基化檢測法。這種方法對標本DNA行重亞硫酸鹽處理及PCR擴增，處理后原甲基化的胞嘧啶被保留，而非甲基化的胞嘧啶變為胸腺嘧啶。隨后用限制性內切酶對轉化后PCR產物切割的特性以識別原標本DNA的甲基化狀況。（見圖4）。

　　圖4： 結合重亞硫酸鹽的限制性內切酶法（COBRA）示意圖。重亞硫酸鹽處理DNA后行PCR擴增，用限制性內切酶(BstUI）識別轉化后序列中的酶切位點，消化產物電泳分離，與完全非甲基化陰性對照組比較，得出序列中特異位點甲基化水平(圖4參考引文[31]并略加修改)。

　　這種方法的優點有：1.方法相對簡單，不需預先知道CpG位點及樣本序列；2.可以進行甲基化水平的定量研究；3.需要樣本量少，可用于石蠟包埋樣本的分析[32]。缺點是：1.只能獲得特殊酶切位點甲基化情況，因此檢測陰性不能排除樣品DNA中存在甲基化的可能[5]；2.由于酶和PCR的使用，只能分析一種特定序列[5]。

　　2.2.6 甲基化敏感性單鏈構象分析（methylation-specific single-strand conformation analysis，MS-SSCA）

　　甲基化敏感性單鏈構象分析（MS-SSCA）又稱重亞硫酸鹽甲基化-PCR-SSCP（Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP）（BiPS），由Maekawa等1999年[32]報道。方法是：先用重亞硫酸鹽處理待測片段，針對非CG二核苷酸區設計引物進行PCR擴增，擴增產物變性后作非變性的聚丙酰胺凝膠電泳，由于DNA電泳時的移動性取決于其二級結構即DNA的空間構象，而后者又由DNA堿基的序列決定。因此，經處理后變性的單鏈DNA將停留在聚丙酰胺膜的不同位置上，這樣甲基化與非甲基化的就被分離開，隨后行單鏈構象多態性分析加以明確（見圖5）：

　　圖5：甲基化敏感性單鏈構象分析（MS-SSCA）示意圖。重亞硫酸鹽處理DNA后，設計引物（非CG二核苷酸區）對處理后的DNA進行擴增, 產物解鏈后行聚丙酰胺凝膠電泳，由于甲基化和非甲基化單鏈DNA形成不同的空間構象，它們在電泳中移動速率不同， 故出現在不同位置，從而判定待測片段中甲基化情況。

　　這種方法的優點是：1.能夠方便的應用于任何序列的甲基化狀態分析；2.能夠對甲基化的等位基因進行半定量；3.可以提示甲基化狀態分布的不均勻性；缺點是：1.只有甲基化水平較高的單鏈才能明顯的區分開，而較低水平的則不易分開，有時會因甲基化的CpG位點隨機和不均勻分布導致電泳條帶出現擁擠、拖尾的現象，故敏感性及準確性略低；2.檢測片段不宜過長。

　　2.2.7 甲基化敏感性變性梯度凝膠電泳（methylation-specific denaturing gradient gel electrophoresis，MS-DGGE）

　　變性梯度凝膠電泳(DGGE)是一種能夠將具有單堿基差別的DNA分離的方法。其原理是：當雙鏈DNA在變性梯度凝膠中進行到與DNA變性溫度對應一致的位置時，DNA部分解鏈（解鏈區域的長度大小不等），與每一個解鏈區域相對應的溫度稱為解鏈溫度(T)。Tm主要由核苷酸的序列決定，這是因為DNA鏈上相鄰堿基間的相互作用對穩定DNA雙螺旋起重要作用。因此，很小的變化（如單堿基變化）也會引起DNA片段Tm值的改變。DGGE系統中，DNA片段在變性梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳時，由于凝膠中變性劑濃度自上而下呈梯度遞增，因此，當DNA片段到達與該區域的T值相當的某一濃度位置時，DNA解鏈變為分枝狀，其移動減慢，停留在凝膠的的某一位置，這樣不同的DNA片段就被分離。mAggerholm等1999年[35]將其用于甲基化的檢測，先用重亞硫酸鹽處理DNA使為甲基化的胞嘧啶轉變為尿嘧啶引起點突變，這樣再結合使用DGGE，經電泳分離、分析該片段的甲基化狀況。

　　這種方法的優點是：DGGE可以用來檢測出除最高溫度解鏈區域以外的所有發生甲基化的DNA片段，需樣品量少，能較直觀的顯示出甲基化情況[36]。缺點是：解鏈溫度和DGGE的變性濃度梯度需要摸索。

　　2.2.8 甲基化敏感性解鏈曲線分析（methylation-specific melting curve analysis，MS-MCA）

　　Worm等[37]2001年報道的MS-MCA是將DNA經重亞硫酸鹽處理與Lightcycle聯用檢測DNA序列甲基化的方法。熒光素標記雙鏈DNA。這種方法根據檢測到的熒光度對應的解鏈溫度，判斷分析研究序列中甲基化的情況。在Lightcycle過程中，隨著溫度升高，逐漸達到DNA雙鏈各解鏈區域的解鏈溫度Tm，DNA呈區域性逐漸解鏈，一般說來，序列中CG含量越高，對應的解鏈溫度越高。由于非甲基化的胞嘧啶經重亞硫酸鹽處理后變為尿嘧啶、PCR后變為胸腺嘧啶，故其所在序列中的CG含量降低，熱穩定性降低，解鏈溫度降低。而甲基化的由于其CG含量高，故其解鏈溫度高。所作結果與標準曲線對照，根據這種特性就可以明確研究序列中CpG的分布區及甲基化程度。（見圖6、圖7）。

　　圖6：甲基化敏感性解鏈曲線分析（MS-MCA）示意圖。完全非甲基化時，解鏈溫度低(如A)；完全甲基化時，解鏈溫度高（如B）；當等位基因的甲基化的發生集中于一條鏈或等位基因甲基化嵌合分布時，解鏈溫度改變（如C、D） （圖6參考引文 [37]）。

　　圖7：甲基化程度與解鏈溫度關系示意圖。p15Ink4b基因的熒光解鏈曲線，重亞硫酸鹽處理HL-60（曲線a， 完全未甲基化的）和MOLT-4（曲線b， 完全甲基化的）這兩個細胞系及取自慢性髓性白血病病人骨髓細胞中p15Ink4b的基因（其曲線為c和d，示部分甲基化的）。曲線a、b、c、d的解鏈峰值分別為81.3℃、88.9℃、84.4℃和86.2℃（圖7參考引文 [37]）。

　　這是一種能對甲基化分布不均勻的DNA樣本進行半定量分析的方法。缺點是：1. 它不能夠精確檢測甲基化的具體位點；2.研究序列的長度不宜過長；3. 該法對低水平的DNA甲基化敏感性低[37]。

　　2.2.9 熒光法（Methylight）

　　Eads等[38]2000年報道的熒光法利用實時PCR（Real-time PCR）測定特定位點甲基化的情況。其過程如下：先用重亞硫酸鹽處理待測DNA片段。設計一個能與待測位點區互補的探針，探針的5'端連接報告熒光，3'端連接淬滅熒光，隨后行實時定量PCR。如果探針能夠與DNA雜交，則在PCR用引物延伸時，TaqDNA聚合酶5'到3'端的外切酶活性會將探針序列上5'端的報告熒光切下，淬滅熒光不再能對報告熒光進行抑制，這樣報告熒光發光，測定每個循環報告熒光的強度即可得到該位點的甲基化情況及水平；同理，若標記的探針未能與DNA雜交，則引物延伸不能跳過未甲基化位點，報告熒光不被切下，不發光。同樣方法，也可對引物進行熒光標記，并通過不同標記的組合，檢測多個位點的甲基化水平[39]。

　　高敏感、快速是本方法最顯著的特點,它可以在非甲基化等位基因超出10000倍的情況下精確的檢測到甲基化的等位基因并定量，而且可以做多樣本、多基因位點的快速分析。此外其具備可重復、所需樣本量少、不需要[12]電泳分離的特點。它可以為臨床標本的分子生物學研究提供可靠的技術支持。缺點是費用高，測定每個位點都要用兩端標有熒光素的探針和一對引物，且受較多因素影響。

　　2.2.8 甲基化敏感性解鏈曲線分析（methylation-specific melting curve analysis，MS-MCA）

　　Worm等[37]2001年報道的MS-MCA是將DNA經重亞硫酸鹽處理與Lightcycle聯用檢測DNA序列甲基化的方法。熒光素標記雙鏈DNA。這種方法根據檢測到的熒光度對應的解鏈溫度，判斷分析研究序列中甲基化的情況。在Lightcycle過程中，隨著溫度升高，逐漸達到DNA雙鏈各解鏈區域的解鏈溫度Tm，DNA呈區域性逐漸解鏈，一般說來，序列中CG含量越高，對應的解鏈溫度越高。由于非甲基化的胞嘧啶經重亞硫酸鹽處理后變為尿嘧啶、PCR后變為胸腺嘧啶，故其所在序列中的CG含量降低，熱穩定性降低，解鏈溫度降低。而甲基化的由于其CG含量高，故其解鏈溫度高。所作結果與標準曲線對照，根據這種特性就可以明確研究序列中CpG的分布區及甲基化程度。（見圖6、圖7）。

　　圖6：甲基化敏感性解鏈曲線分析（MS-MCA）示意圖。完全非甲基化時，解鏈溫度低(如A)；完全甲基化時，解鏈溫度高（如B）；當等位基因的甲基化的發生集中于一條鏈或等位基因甲基化嵌合分布時，解鏈溫度改變（如C、D） （圖6參考引文 [37]）。

　　圖7：甲基化程度與解鏈溫度關系示意圖。p15Ink4b基因的熒光解鏈曲線，重亞硫酸鹽處理HL-60（曲線a， 完全未甲基化的）和MOLT-4（曲線b， 完全甲基化的）這兩個細胞系及取自慢性髓性白血病病人骨髓細胞中p15Ink4b的基因（其曲線為c和d，示部分甲基化的）。曲線a、b、c、d的解鏈峰值分別為81.3℃、88.9℃、84.4℃和86.2℃（圖7參考引文 [37]）。

　　這是一種能對甲基化分布不均勻的DNA樣本進行半定量分析的方法。缺點是：1. 它不能夠精確檢測甲基化的具體位點；2.研究序列的長度不宜過長；3. 該法對低水平的DNA甲基化敏感性低[37]。

　　2.2.9 熒光法（Methylight）

　　Eads等[38]2000年報道的熒光法利用實時PCR（Real-time PCR）測定特定位點甲基化的情況。其過程如下：先用重亞硫酸鹽處理待測DNA片段。設計一個能與待測位點區互補的探針，探針的5'端連接報告熒光，3'端連接淬滅熒光，隨后行實時定量PCR。如果探針能夠與DNA雜交，則在PCR用引物延伸時，TaqDNA聚合酶5'到3'端的外切酶活性會將探針序列上5'端的報告熒光切下，淬滅熒光不再能對報告熒光進行抑制，這樣報告熒光發光，測定每個循環報告熒光的強度即可得到該位點的甲基化情況及水平；同理，若標記的探針未能與DNA雜交，則引物延伸不能跳過未甲基化位點，報告熒光不被切下，不發光。同樣方法，也可對引物進行熒光標記，并通過不同標記的組合，檢測多個位點的甲基化水平[39]。

　　高敏感、快速是本方法最顯著的特點,它可以在非甲基化等位基因超出10000倍的情況下精確的檢測到甲基化的等位基因并定量，而且可以做多樣本、多基因位點的快速分析。此外其具備可重復、所需樣本量少、不需要[12]電泳分離的特點。它可以為臨床標本的分子生物學研究提供可靠的技術支持。缺點是費用高，測定每個位點都要用兩端標有熒光素的探針和一對引物，且受較多因素影響。

　　2.2.8 甲基化敏感性解鏈曲線分析（methylation-specific melting curve analysis，MS-MCA）

　　Worm等[37]2001年報道的MS-MCA是將DNA經重亞硫酸鹽處理與Lightcycle聯用檢測DNA序列甲基化的方法。熒光素標記雙鏈DNA。這種方法根據檢測到的熒光度對應的解鏈溫度，判斷分析研究序列中甲基化的情況。在Lightcycle過程中，隨著溫度升高，逐漸達到DNA雙鏈各解鏈區域的解鏈溫度Tm，DNA呈區域性逐漸解鏈，一般說來，序列中CG含量越高，對應的解鏈溫度越高。由于非甲基化的胞嘧啶經重亞硫酸鹽處理后變為尿嘧啶、PCR后變為胸腺嘧啶，故其所在序列中的CG含量降低，熱穩定性降低，解鏈溫度降低。而甲基化的由于其CG含量高，故其解鏈溫度高。所作結果與標準曲線對照，根據這種特性就可以明確研究序列中CpG的分布區及甲基化程度。（見圖6、圖7）。

　　圖6：甲基化敏感性解鏈曲線分析（MS-MCA）示意圖。完全非甲基化時，解鏈溫度低(如A)；完全甲基化時，解鏈溫度高（如B）；當等位基因的甲基化的發生集中于一條鏈或等位基因甲基化嵌合分布時，解鏈溫度改變（如C、D） （圖6參考引文 [37]）。

　　圖7：甲基化程度與解鏈溫度關系示意圖。p15Ink4b基因的熒光解鏈曲線，重亞硫酸鹽處理HL-60（曲線a， 完全未甲基化的）和MOLT-4（曲線b， 完全甲基化的）這兩個細胞系及取自慢性髓性白血病病人骨髓細胞中p15Ink4b的基因（其曲線為c和d，示部分甲基化的）。曲線a、b、c、d的解鏈峰值分別為81.3℃、88.9℃、84.4℃和86.2℃（圖7參考引文 [37]）。

　　這是一種能對甲基化分布不均勻的DNA樣本進行半定量分析的方法。缺點是：1. 它不能夠精確檢測甲基化的具體位點；2.研究序列的長度不宜過長；3. 該法對低水平的DNA甲基化敏感性低[37]。

　　2.2.9 熒光法（Methylight）

　　Eads等[38]2000年報道的熒光法利用實時PCR（Real-time PCR）測定特定位點甲基化的情況。其過程如下：先用重亞硫酸鹽處理待測DNA片段。設計一個能與待測位點區互補的探針，探針的5'端連接報告熒光，3'端連接淬滅熒光，隨后行實時定量PCR。如果探針能夠與DNA雜交，則在PCR用引物延伸時，TaqDNA聚合酶5'到3'端的外切酶活性會將探針序列上5'端的報告熒光切下，淬滅熒光不再能對報告熒光進行抑制，這樣報告熒光發光，測定每個循環報告熒光的強度即可得到該位點的甲基化情況及水平；同理，若標記的探針未能與DNA雜交，則引物延伸不能跳過未甲基化位點，報告熒光不被切下，不發光。同樣方法，也可對引物進行熒光標記，并通過不同標記的組合，檢測多個位點的甲基化水平[39]。

　　高敏感、快速是本方法最顯著的特點,它可以在非甲基化等位基因超出10000倍的情況下精確的檢測到甲基化的等位基因并定量，而且可以做多樣本、多基因位點的快速分析。此外其具備可重復、所需樣本量少、不需要[12]電泳分離的特點。它可以為臨床標本的分子生物學研究提供可靠的技術支持。缺點是費用高，測定每個位點都要用兩端標有熒光素的探針和一對引物，且受較多因素影響。

　　2.2.8 甲基化敏感性解鏈曲線分析（methylation-specific melting curve analysis，MS-MCA）

　　Worm等[37]2001年報道的MS-MCA是將DNA經重亞硫酸鹽處理與Lightcycle聯用檢測DNA序列甲基化的方法。熒光素標記雙鏈DNA。這種方法根據檢測到的熒光度對應的解鏈溫度，判斷分析研究序列中甲基化的情況。在Lightcycle過程中，隨著溫度升高，逐漸達到DNA雙鏈各解鏈區域的解鏈溫度Tm，DNA呈區域性逐漸解鏈，一般說來，序列中CG含量越高，對應的解鏈溫度越高。由于非甲基化的胞嘧啶經重亞硫酸鹽處理后變為尿嘧啶、PCR后變為胸腺嘧啶，故其所在序列中的CG含量降低，熱穩定性降低，解鏈溫度降低。而甲基化的由于其CG含量高，故其解鏈溫度高。所作結果與標準曲線對照，根據這種特性就可以明確研究序列中CpG的分布區及甲基化程度。（見圖6、圖7）。

　　圖6：甲基化敏感性解鏈曲線分析（MS-MCA）示意圖。完全非甲基化時，解鏈溫度低(如A)；完全甲基化時，解鏈溫度高（如B）；當等位基因的甲基化的發生集中于一條鏈或等位基因甲基化嵌合分布時，解鏈溫度改變（如C、D） （圖6參考引文 [37]）。

　　圖7：甲基化程度與解鏈溫度關系示意圖。p15Ink4b基因的熒光解鏈曲線，重亞硫酸鹽處理HL-60（曲線a， 完全未甲基化的）和MOLT-4（曲線b， 完全甲基化的）這兩個細胞系及取自慢性髓性白血病病人骨髓細胞中p15Ink4b的基因（其曲線為c和d，示部分甲基化的）。曲線a、b、c、d的解鏈峰值分別為81.3℃、88.9℃、84.4℃和86.2℃（圖7參考引文 [37]）。

　　這是一種能對甲基化分布不均勻的DNA樣本進行半定量分析的方法。缺點是：1. 它不能夠精確檢測甲基化的具體位點；2.研究序列的長度不宜過長；3. 該法對低水平的DNA甲基化敏感性低[37]。

　　2.2.9 熒光法（Methylight）

　　Eads等[38]2000年報道的熒光法利用實時PCR（Real-time PCR）測定特定位點甲基化的情況。其過程如下：先用重亞硫酸鹽處理待測DNA片段。設計一個能與待測位點區互補的探針，探針的5'端連接報告熒光，3'端連接淬滅熒光，隨后行實時定量PCR。如果探針能夠與DNA雜交，則在PCR用引物延伸時，TaqDNA聚合酶5'到3'端的外切酶活性會將探針序列上5'端的報告熒光切下，淬滅熒光不再能對報告熒光進行抑制，這樣報告熒光發光，測定每個循環報告熒光的強度即可得到該位點的甲基化情況及水平；同理，若標記的探針未能與DNA雜交，則引物延伸不能跳過未甲基化位點，報告熒光不被切下，不發光。同樣方法，也可對引物進行熒光標記，并通過不同標記的組合，檢測多個位點的甲基化水平[39]。

　　高敏感、快速是本方法最顯著的特點,它可以在非甲基化等位基因超出10000倍的情況下精確的檢測到甲基化的等位基因并定量，而且可以做多樣本、多基因位點的快速分析。此外其具備可重復、所需樣本量少、不需要[12]電泳分離的特點。它可以為臨床標本的分子生物學研究提供可靠的技術支持。缺點是費用高，測定每個位點都要用兩端標有熒光素的探針和一對引物，且受較多因素影響。