蛋白表達技術全攻略

1.啟動子

啟動子是DNA鏈上一段能與RNA聚合酶結合并起始RNA合成的序列,它是基因表達不可缺少的重要調控序列.沒有啟動子,基因 就不能轉錄.由于細菌 RNA聚合酶不能識別真核基因的啟動子,因此原核表達載體所用的啟動子必須是原核啟動子.

原核啟動子是由兩段彼此分開且又高度保守的核苷酸 序列組成,對mRNA的合成極為重要.在轉錄起始點上游5～10 bp處,有一段由6～8個堿基組成,富含A和T的區域,稱為Pribnow 盒,又名TATA 盒或-10區.來源不同的啟動子,Pribnow 盒的堿基順序稍有變化.在距轉錄起始位點上游35 bp處,有一段由10 bp組成的區域,稱為-35區.轉錄時大腸桿菌RNA聚合酶識別并結合啟動子.-35區與RNA聚合酶 s 亞基結合,-10區與RNA聚合酶的核心酶結合,在轉錄起始位點附近DNA被解旋形成單鏈,RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯鍵,以后在RNA 聚合酶作用下向前推進,形成新生的RNA鏈.

原核表達系統中通常使用的可調控的啟動子有Lac(乳糖啟動子)、Trp(色氨酸啟動子)、Tac(乳糖和色氨酸的雜合啟動子)、l PL (l 噬菌體的左向啟動子)、T7噬菌體啟動子等.

(1)Lac啟動子：它來自大腸桿菌的乳糖操縱子,是DNA分子上一段有方向的核苷酸序列,由阻遏蛋白基因(LacI)、啟動基因(P)、操縱基因 (O)和編碼3個與乳糖利用有關的酶的基因結構所組成.Lac啟動子受分解代謝系統的正調控和阻遏物的負調控.正調控通過CAP(catabolite gene activation protein)因子和cAMP來激活啟動子,促使轉錄 進行.負調控則是由調節基因產生LacZ阻遏蛋白,該阻遏蛋白能與操縱基因結合阻止轉錄.乳糖及某些類似物如IPTG可與阻遏蛋白形成復合物,使其構型改變,不能與O基因結合,從而解除這種阻遏,誘導轉錄發生.

(2)trp啟動子：它來自大腸桿菌的色氨酸操縱子,其阻遏蛋白必須與色氨酸結合才有活性.當缺乏色氨酸時,該啟動子開始轉錄.當色氨酸較豐富時,則停止轉錄.b-吲哚丙烯酸可競爭性抑制色氨酸與阻遏蛋白的結合,解除阻遏蛋白的活性,促使trp啟動子轉錄.

(3)Tac啟動子：Tac啟動子是一組由Lac和trp啟動子人工構建的雜合啟動子,受Lac阻遏蛋白的負調節,它的啟動能力比Lac和trp都強.其中Tac 1是由Trp啟動子的-35區加上一個合成的46 bp DNA片段(包括Pribnow 盒)和Lac操縱基因構成,Tac 12是由Trp的啟動子-35區和Lac啟動子的-10區,加上Lac操縱子中的操縱基因部分和SD序列融合而成.Tac啟動子受IPTG的誘導.

(4)l PL 啟動子：它來自 l 噬菌體早期左向轉錄啟動子,是一種活性比Trp啟動子高11倍左右的強啟動子.l PL 啟動子受控于溫度敏感的阻遏物cIts857.在低溫(30 ℃ )時,cIts857阻遏蛋白可阻遏PL 啟動子轉錄.在高溫(45 ℃ )時,cIts857蛋白失活,阻遏解除,促使PL 啟動子轉錄.系統由于受cIts857作用,尤其適合于表達對大腸桿菌有毒的基因產物,缺點是溫度轉換不僅可誘導PL 啟動子,也可誘導熱休克基因,其中有一些熱休克基因編碼蛋白酶.如果用 l 噬菌體cI+ 溶源菌,并用絲裂霉素C或萘啶酮酸進行誘導,可緩解這一矛盾.

(5)T7噬菌體啟動子：它是來自T7噬菌體的啟動子,具有高度的特異性,只有T7RNA聚合酶才能使其啟動,故可以使克隆化基因獨自得到表達.T7RNA聚合酶的效率比大腸桿菌 RNA聚合酶高5倍左右,它能使質粒沿模板連續轉錄幾周,許多外源終止子都不能有效地終止它的序列,因此它可轉錄某些不能被大腸桿菌RNA聚合酶有效轉錄的序列.這個系統可以高效表達其他系統不能有效表達的基因.但要注意用這種啟動子時宿主中必須含有T7RNA聚合酶.應用T7噬菌體表達系統需要2個條件：第一是具有T7噬菌體RNA聚合酶,它可以由感染的 l 噬菌體或由插入大腸桿菌染色體上的一個基因拷貝產生;第二是在一個待表達基因上游帶有T7噬菌體啟動子的載體.

2.SD序列

1974年Shine和Dalgarno首先發現,在mRNA上有核糖體的結合位點,它們是起始密碼子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp處的由3～9 bp組成的序列.這段序列富含嘌呤核苷酸,剛好與16S rRNA 3 ￠ 末端的富含嘧啶的序列互補,是核糖體RNA的識別與結合位點.以后將此序列命名為Shine-Dalgarno序列,簡稱SD序列.它與起始密碼子AUG 之間的距離是影響mRNA轉錄、翻譯成蛋白的重要因素之一,某些蛋白質與SD序列結合也會影響mRNA與核糖體的結合,從而影響蛋白質的翻譯.另外,真核基因的第二個密碼子必須緊接在ATG之后,才能產生一個完整的蛋白質.

3.終止子

在一個基因的3￠末端或是一個操縱子的3￠末端往往有特定的核苷酸序列,且具有終止轉錄功能,這一序列稱之為轉錄終止子,簡稱終止子 (terminator).轉錄終止過程包括：RNA聚合酶停在DNA模板上不再前進,RNA的延伸也停止在終止信號上,完成轉錄的RNA從RNA聚合酶上釋放出來.對RNA聚合酶起強終止作用的終止子在結構上有一些共同的特點,即有一段富含A/T的區域和一段富含G/C的區域,G/C富含區域又具有回文對稱結構.這段終止子轉錄后形成的RNA具有莖環結構,并且有與A/T富含區對應的一串U.轉錄終止的機制較為復雜,并且結論尚不統一.但在構建表達載體時,為了穩定載體系統,防止克隆 的外源基因表達干擾載體的穩定性,一般都在多克隆 位點的下游插入一段很強的rrB核糖體RNA的轉錄終止子.