限制性內切酶（ restriction endonuclease ）也稱限制性酶（ restriction enzyme ），是由 W. Arber ， H. Smith 和 D. Nathans 等人（ 1979 年）從細菌中分離的一類酶。限制酶具有極高的專一性，識別雙鏈 DNA 上特定的位點，將兩條鏈都切斷，形成粘末端或平末端。限制酶可以用來解剖纖細的 DNA 分子，在分析染色體結構、制作 DNA 的限制酶譜、測定較長的 DNA 序列、基因的分離、基因的體外重組等研究中是不可缺少的工具。對于研究 DNA 的分子生物學家來說，這是一把天賜神刀——分子生物刀。

限制性酶的生物學功能在于防御或“限制”入侵細胞的外 DNA （如噬菌體 DNA ）。原核生物利用他們獨特的限制性內切酶把外來 DNA 切成無感染性的片段。但不能降解自身細胞中的染色體 DNA ，因為細胞內還有“共座”的 DNA 甲基化酶修飾相應序列使之受到保護。

限制酶可被分成三種類型。 I 型和Ⅲ型限制酶水解 DNA 需要消耗 ATP ，全酶中的部分亞基有通過在特殊堿基上補加甲基基團對 DNA 進行化學修飾的活性。 I 型限制性內切酶在隨機位點切割 DNA ；Ⅲ型限制酶識別雙鏈 DNA 的特異核苷酸序列，并在這個位點內或附近切開 DNA 雙鏈。

Ⅱ型限制性內切酶已被廣泛應用于 DNA 分子的克隆和序列分析，這是因為它們水解 DNA 不需要 ATP ，并且也不以甲基化或其他方式修飾 DNA 。最重要的是它們在它們所識別的特殊核苷酸順序內或附近切割 DNA 鏈。這些特殊序列常常含 4 個或 6 個核苷酸殘基，通常具回文結構（ palindromic structure ），切割后形成粘末端（或平末端）。例如，大腸桿菌的一限制酶稱 EcoR I ，它識別下列六核苷酸順序：

5' …… GAATTC …… 3'

3' …… CTTAAC …… 5'

這種回文結構的兩條鏈以 5' → 3' 方向閱讀序列都是一樣的結構，當 EcoR I 遇到 DNA 的這種序列時，它會對這種 DNA 鏈進行交錯切割，產生突出的 5' 末端。

5' …… G AATTC …… 3'

3' …… CTTAA C …… 5'

有些限制酶，如 Pst I ，它識別序列 5'-CTGCAG-3' ，并在 A 與 G 之間切割 DNA 雙鏈產生 3' 突出粘性末端。還有些限制酶，如 Bal I ， DNA 鏈產生具有平末端（ blunt end ）的 DNA 片段。

限制酶的命名較為特殊。以 EcoR I 為例加以說明。第一個大寫字母 E 為大腸桿菌 E. coil 的屬名的第一個字母，第二、三兩個小寫字母 co 為它的種名的頭兩個字母。第四個字母用大寫 R ，表示所用大腸桿菌的菌株。最后一個羅馬字表示從該細菌中分離出來的這一類酶的編號。目前提純的限制酶已很多，常用的約有 100 多種，并且已轉化成為商品。大大節約了研究人員的時間。

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