霉菌特異性定量聚合酶鏈反應（PCR）：霉菌分析中的新標準

摘要：霉菌在地球生物進程中是一個必需成分，無處不在。它們不僅能危害健康，例如導致感染和過敏，還能毀壞農作物、污染食品和醫藥品。因此，及時地發現并消滅多數有問題的霉菌是相當重要的。通過霉菌特異性定量聚合酶鏈反應技術的最新發展及應用，現在可以準確地識別室內的霉菌，并且利用其較高的定量精度，可以建立用于確定不正常霉菌環境的預測模型。

Abstract：Molds are an integral part of the earth’s biological processes, and as such are ubiquitous. But they can cause health problems, such as infections and allergies; they can destroy crops, and contaminate food and pharmaceuticals. Accordingly, it is important that the molds that are most problematic be identified and eliminated in a timely manner. Through the recent development and application of the technique of mold-specific quantitative polymerase chain reaction, indoor molds can now be identified accurately and with such quantitative precision that predictive models are emerging that can help define abnormal mold conditions.

    霉菌不僅能導致包括感染和過敏的健康問題，還能毀壞農作物，污染食品和醫藥品。它們是不可避免的。霉菌在地球生物進程中扮演著最基本的角色。多數有問題的霉菌能被發現，并且可以進行定量分析，以便及時地消除。通過霉菌特異性定量聚合酶鏈反應（MSQPCR）技術的最新發展及應用，現在可以準確地識別室內的霉菌。并且利用其較高的定量精度，可以建立用于確定不正常霉菌環境的預測模型。

1 MSQPCR是如何提高霉菌檢測和定量的

　　MSQPCR是一種用于檢測霉菌的高度精確和高靈敏度的分子技術。以前識別環境中霉菌的方法是在特定的培養基中培養霉菌，但實際上樣品中的霉菌只有少數能夠接受培養基，并在實驗室生長。長期以來用于定量霉菌的方法是用肉眼計數霉菌孢子。這是一個非常緩慢、費力并且常常帶有主觀因素的過程，只有具有很高技能的人才能進行。

　　MSQPCR可以避免幾個世紀以來一直沿用的用于識別和定量霉菌的方法的局限性。因為它是一種基于DNA序列的檢測系統，所以具有客觀性和特異性。

2 樣品制備

　　為了評估室內環境中的霉菌，通常需要收集空氣或者灰塵。第一步通過珠粒攪拌方法提取樣品中的DNA（圖1），這要花費1min的時間。對于大多數空氣樣品，簡單地離心以后得到的懸浮物可以用于進行分析。對于灰塵樣品，離心后得到的懸浮物需要進一步純化。

　　與最初的PCR過程不同，定量PCR（QPCR，于1997年由應用生物系統公司（FosterCity），CA發展的）向初始的正向和反向引物中加入了一種雙重熒光標記DNA探針（圖2）。引物與探針和適量的酶及其他試劑混合從而完成反應。由于引物和探針是QPCR反應過程中關鍵的成分，所以它們一定要被設計成具有種屬特異性。

　　如圖3所示，將少量的樣品DNA 抽提物（懸浮物）加入到含有用于特異霉菌的引物和探針的MSQPCR反應混合物中（步驟1）。對于每個待分析的目標霉菌樣品需要重復此步驟。在序列檢測熱循環器中加熱DNA（步驟2），這會導致雙螺旋離解成單鏈。霉菌特異性引物和探針將與樣品DNA發生相互作用。

　　現在有許多序列檢測器的廠商；最近有綜述介紹這些儀器^[1］。序列檢測器可以進行MSQPCR中PCR反應的加熱和冷卻，也可以檢測制備的DNA探針發射的熒光。這些儀器價錢從30到8萬美金不等。這取決于可同時進行反應的數量（1到384）。

4 MSQPCR在家庭環境研究中的應用

　　人們通常都很重視家庭建筑中因過多霉菌生長所帶來的危險。因此， 作者十分關注MSQPCR用于研究室內霉菌種群及其在一個家庭的居住環境中發生的變化。在一個家庭的居住環境中，當環境的濕度變得不正常時，某些種類的霉菌就會大量繁殖，而某些就會減少，還有一些會維持原狀，甚至會出現新的霉菌（圖5）。也就是說，室內空間的生態系統，包括霉菌種群，發生了變化。但是，由于室內環境之間也存在著極大的差異，人們不能期望所有的含有水分的房子或建筑都具有相同的霉菌生長機會。

　　美國環保署（辛辛那提，俄亥俄州）聯合住房和城市發展部（HUD,華盛頓D.C.）正在進行一個跨越全美的全國性室內霉菌研究工作。MSQPCR技術正被用于這項研究。這項研究的目的是要獲得發霉屋子和“正常”屋子中作為指標霉菌的GM值比較。研究者將利用這些大量的數據來更徹底地驗證并確認GM比率值方法的可預測性。

5 MSQPCR在醫院環境、食物和制藥工廠中的應用

　　MSQPCR還有許多其他方面的應用。在醫療保健環境中，醫院的真菌感染有著很高的致死率。因此控制感染的醫師需要經常監測某些種類的霉菌，尤其是曲霉菌。MSQPCR的靈敏度在這些環境的監測中相當有用。醫院在進行建設和翻新工程時，監督可能存在的致病性真菌是非常關鍵的。建筑工作能夠激起各種類型的霉菌，包括那些最容易引起感染的霉菌。現在， MSQPCR提供的實時監控數據可以幫助醫院的感染控制人員監控病人環境中潛在的致病性霉菌的出現^[4,5］。盡管霉菌是可以控制的，但前提條件中是我們必須及時地發現并快速地消除它們。

　　在農業生產方面，霉菌是污染人和動物食品的毒枝菌素的來源。霉菌也會威脅和毀壞莊稼。MSQPCR能夠用于監測植物病原體以及田地和飼料儲存倉中的致毒真菌^[6］。

6 MSQPCR用于環境霉菌分析的其他益處

　　MSQPCR除了具有高度的特異性和可以進行定量分析的特點以外，一個很重要的優點就是它的檢測速度非常快。大約3h或者更少的時間就能得到結果。和需要數周之久的、低特異性的、非常古老的“標準”霉菌培養技術相比，這些優點說明MSQPCR是一項非常有用的技術。由于MSQPCR給霉菌分析領域帶來了新的動力，我們處于一個了解和控制破壞性霉菌的新階段。

　　目前100多種常見的有問題的霉菌已有了相應的DNA探針和引物。美國環保署促進了MSQPCR的使用，使得人們可以通過美國和歐洲一些已授權的公司獲得該技術。

參考文獻:

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