可提高核磁共振譜圖數據靈敏度的微線圈探針

摘要：核磁共振（NMR）是化學家們對化合物進行結構鑒定時所用的最有力的工具之一，但其最大的缺陷就是靈敏度低。研究人員為此發展了許多方法來克服這一弊端，并已經取得了一些進展。然而，這些方法中的絕大部分都依賴于昂貴的儀器設備或配件。本文介紹了一種可以在不顯著增加系統成本基礎上提高靈敏度的微線圈技術。

Abstract：NMR spectroscopy is one of the most powerful techniques in the chemist’s toolbox for structure determination, but its most significant disadvantage is its low sensitivity. Many approaches have been developed to overcome this drawback of NMR, and advances in sensitivity have been achieved. However, most have involved the installation of expensive instrumentation or accessories. This paper describes the use of microcoil technology, which improves sensitivity without a substantial increase in the cost of the system.

    核磁共振（NMR）是一種強有力的分析方法，常用于提供化合物的結構信息及其他化學屬性，如樣品的成分。它的應用結果常用于反應動力學的研究。盡管NMR能提供大量的信息，但它的檢測靈敏度卻比其他分析檢測方法（如質譜或紫外檢測）低幾個數量級。人們已發展了許多方法來提高N MR檢測的信噪比（S/N），例如使用高強磁場和低溫冷凍探針。這些方法的確改善了信噪比，但同時也顯著提高了儀器價格。提高檢測靈敏度的另一個方法就是增大樣品的體積，但這對于許多很難獲得大量樣品的研究，尤其是感興趣的生物分子的研究，是不可行的。近年來，微線圈技術的應用可以顯著提高NMR 的檢測靈敏度，而成本卻比低溫冷凍探針低很多^[1］。

　　將樣品放入到微線圈探針是一個與提高檢測靈敏度密切相關的重要問題。必須對所有因素進行優化，以便使系統的通量最大化，并且適合分析者的使用。許多設備使用了高通量的自動進樣器，而其他設備中則采用了色譜或電泳分離方法。因而需要建立一種完美銜接的分析方法來優化分析實驗室的通量。

　　本文介紹了通過微線圈技術來提高NMR檢測靈敏度的方法。討論了包括微流注射、固相萃取（SPE）、HPLC、電遷移等許多樣品處理方法。

1 應用微線圈優化用于微克和亞微克級質量分析的NMR靈敏度

　　一般地，射頻（RF）接受器線圈應與樣品完全吻合以確保檢測靈敏度高。一個設計合理的NMR探針可以使觀測因子和填充因子均最大化。觀測因子是指RF線圈觀測到的樣品體積與分析所需的總樣品體積的比值；填充因子是指RF線圈觀測到的樣品體積與線圈體積的比值。由于線圈的靈敏度與其大小成反比，因此一個使用1mm RF線圈的探針會比一個使用將近10mm RF線圈的常規探針的質量靈敏度提高十多倍。由于尺寸小，而且是與磁化率匹配的專利化方法，商品化的CapNMR^TM微線圈探針（Protasis，Inc.，Marlboro，MA）易于使用，而且只需要一些易獲得的系統夾片即可以滿足分辨規格。關于微線圈N M R 設計的詳情可參見參考文獻^[1］。

　　圖1 是一個微線圈應用的例子。它給出了分別應用CapNMR探針和低溫冷凍探針對一個未知樣品進行分析的NMR譜圖。盡管兩個圖譜中S/N 是一樣的，但由于質量檢測時所用的溶劑體積相差100倍， 因此用CapNMR探針得到的圖譜的背景噪聲實際上相當小。

2 微線圈用于獲得生物分子樣品的NMR 數據

　　因為獲得大量蛋白質（或其他大分子）樣品是非常困難或麻煩的，因此應用微線圈來采集生物分子的NMR圖譜數據具有明顯優勢。最近，Peti等^[2]利用TXI HCNz-grad CapNMR探針來確定蛋白質折疊和一個10kD蛋白質( Thermotoga maritima的TM0979)序列特異性的骨架分布。這種探針非常適合獲得從未經優化的、高度自動化的蛋白質表達鏈上生產的蛋白質樣品的NMR圖譜，而采用這種方法獲得的蛋白質的量不足以用傳統的5-mm探針NMR進行分析。該探針為結構蛋白質組計劃中研究蛋白質折疊開辟了一條嶄新的道路。

　　Peti 及同事們應用基于CapNMR探針的異核三重共振HNCA和HNCOCA實驗確定了序列特異性的骨架分布。研究組在HCCH-TOCSY實驗中，第一次證實了在脂肪區和芳香區之間的TOCSY轉移。該實驗正是由于CapNMR探針需求的能量低、質量靈敏度高而得以進行。由于RF能量的限制，該實驗在其他更大的探針上是不可能實現的。

3 自動化和樣品處理

　　對許多需要通過自動進樣器不斷向NMR探針送入大量樣品的實驗室而言，高通量是一個日益嚴峻的問題。每個樣品的總時間是一個關鍵問題，它取決于樣品在探針中的停留時間以及樣品的制備和輸送。當使用微線圈時，檢測的靈敏度提高，因此獲得數據所需的樣品停留時間就會減少。此外，還可以通過優化樣品制備和輸送過程來縮短時間。

　　在NMR流動注射體系中最廣泛使用的NMR 自動系統是215型液體處理器（Gilson，Middleton，WI）。Protasis 和MRM（Savoy，IL）將這種液體處理器與一個高壓HPLC梯度泵結合使用，開發了一種適用于CapNMR探針的上樣方法。該技術已被許多大制藥公司用來改造適合CapNMR探針的流動NMR系統。

　　GlaxoSmithKline（Research Triangle Park，NC）的科學家們通過引入可顯著改善出錯平均時間的過濾器維護方法促進了該技術的發展，實現了在不更換過濾器的情況下可以進行上千個樣品的無錯進樣。其研究中所使用的Inova600 兆赫NMR儀的系統（Varian，Palo Alto，CA）包括一個特殊的針頭（Gilson）、加載端口（Protasis/MRM）、過濾器和CapNMR探針。圖2 所示為從96孔板采集得到的圖譜。這種毛細管流動自動化系統需要相當少的樣品和溶劑，提供更短的系統休整時間和更小的溶劑保留峰。

　　Open Access Automation NMR系統（Protasis/MRM）由一個用以控制CTC自動進樣器（Leap Technologies, Carrboro, NC）的用戶界面和NMR 組成。它能夠和所有商品化的NMR儀配套使用，并能提供一個包括樣品控制、報告管理和信息說明在內的以使用者為中心的系統視圖。其液體處理器是針對微升體積樣品而特殊設計的。

4 色譜和電泳分離與微線圈NMR檢測的聯用

　　由于能夠給分析人員提供重要的結構信息，因此NMR通常被用作某些分離技術（如HPLC和電泳分離、固相萃取）的檢測器。在與這些分析工具聯用時，CapNMR探針尤其有用。這是因為探針體積（約5－10μL）與洗脫峰的體積相匹配，能為檢測提供一個寬的動態范圍，從而可以使研究人員獲得窄峰，檢測到與利用標準探針相比更小的樣品量。相反，當使用標準探針時，探針的動態范圍與洗脫峰的體積不匹配，就需要更多的樣品量。下面部分將介紹微線圈NMR與分離技術聯用的典型應用。

4.1 HPLC

　　在近期的研究中，人們實現了Inova 500兆赫NMR系統和帶有二極管陣列檢測器（其用于檢測洗脫時感興趣的峰，然后通過NM R 對峰進行斷流檢測）的CapLC毛細管HPLC系統（Waters Corp.，Milford，MA）的聯用。帶有1.1 μL 流動池體積、實驗室自制微線圈探針的N M R 能夠通過氫譜對毛細管HPLC分離的母育酚、α -生育酚、β -生育酚、γ -生育酚、δ -生育酚及α -生育酚醋酸鹽進行連續監測和及時鑒定。樣品中每種感興趣的化合物的量可以少至1.33μg。該系統可以對納克級樣品（如37 ng的α－蒎烯）提供有用的圖譜（圖3）^[3］。此外，采用斷流技術能夠對α - 生育酚的2-D1H1H，COSY NMR譜圖進行結構確認。
 

　　CapLC系統能被設置進行自動化的毛細管SPE。與色譜柱不同，SPE柱可被及時地反復洗脫。一旦洗脫時間被確定，CapLC可經設置進行重復操作。確定停流時間后，可觸發NMR的控制臺來獲取數據。毛細管SPE-CapNMR的另一個優點是溶劑保留峰相對較小。這是因為與帶有大體流動池的探針相比，CapNMR探針可產生更小的溶劑背景信號。高通量和96孔板SPE形式用于微流進樣目前正處于研究階段中。

5 結論

　　帶有微線圈的NMR可以顯著提高系統檢測靈敏度。與標準探針比較，可獲得更少量樣品的數據。當獲得樣品花費時間多、精力大時（比如進行雜質分析、降解研究、代謝物及天然產物研究），檢測靈敏度的提高非常重要。由于可以使用更少量的樣品，分析人員不必提取得到更多樣品。當使用多孔板時，可對有限的樣品進行多次分析。

參考文獻：

1. Lacey ME, Subramanian R, Olson DL , Webb AG, Sweedler JV. Chem Rev，1999;99:3133-52.
   
2. Peti W, Norcross J, Eldridge G, O＇Neil-Johnson M.J Amer Chem Soc 2004;126:5873-8.
   
3. Lacey ME, Tan ZJ,Webb AG, Sweedler JV.J Chromatogr A，2001;922:139-49.
   
4. Koegler W, Ivory C.J Chromatogr A，1996 ;229:229-36.
   
5. Greenlee R, Ivory C. Biotechnol Progr, 1998;14:300-8.
   
6. Huang Z, Ivory C. Anal Chem，1999 ;71:1628-32.