白毛茛中生物堿的提取和高效液相色譜分析

出于新藥開發的目的，制藥企業對天然產物產生了很大興趣。白毛茛是美洲本土的一種草本藥用植物，由美國印第安人傳入歐洲，它的名稱來源于該植物金黃色的根。據稱白毛茛有抗炎、抗生等生理活性，吸引了人們的關注。生物堿是白毛茛的活性成分，主要包括黃連素和黃連堿。非洲防已堿是一種與黃連素聯系密切的生物堿。白毛茛不含有該生物堿，但是人們在中藥黃連中發現了它的存在。天然產物的管理部門和廠家面臨的主要任務就是如何評價草藥中活性成分的安全性和有效性以及如何對其中的活性成分進行定性和定量。本文描述的高效液相色譜分析法被證明是一種行之有效的分析測試方法。

There is always a keen interest in natural products by the pharmaceutical industry in order to increase the store of therapeutic products for sale to the public. Goldenseal is a native herbal medicinal plant invoduced to European settlers by Native Americans. In name is derived from the bright yellow color of its roots. Goldenseal is of current interest for in purported allti-inHammatory and antibiotic properties. The primary active ingredienn are berberine and hydrastine alkaloids, among others. Palmatine, which is closely related to berberine, is not found in Goldenseal, but is found in the Chinese medicinal plant Huanglian. Both regulators and users of herbal products are faced with the tasks of assessing the safety of such products and verifying the truth in labeling regarding the quality and quantity of the active ingredients.Accordingly, the HPLC procedure described in this article provides an effective means of analysis.

        白毛茛(hydrastis canadenis L．)^[1，2]是美洲本土的一種草本藥用植物，由切羅基族印第安人傳入歐洲^[3]。它的名稱來源于該植物金黃色的根(見圖1)。據稱白毛茛有抗炎、抗生等生理活性，因此吸引了人們的關注。它也被用來治療鼻子堵塞、感冒、流感和各種腸道失調等疾病。隨著白毛莫應用領域的拓寬，其需求也大大增加，預計年銷售額在250000英鎊以上。

　　生物堿是白毛茛的活性成分，主要包括黃連素和黃連堿。還有一些低豐度的生物堿，如白毛茛分堿、5-羥(基)小檗堿和氫化小檗堿(結構式見圖2)。非洲防已堿是一種與黃連素聯系密切的生物堿。北美黃連(H. cannadenis)一般不含有非洲防已堿，但是人們已經從中藥??黃連(Coptis chinensis)、 日本藥??金線(Gildthread)^[4](Coptis japonica)和其他含有黃連素的植物中發現了非洲防已堿。

 1 分析方法的建立

　　草藥的療效是建立在活性成分的基礎上的。現在，管理部門和廠家面臨的兩個主要任務就是：

    (1)如何評價草藥中活性成分的安全性和有效性；

    (2)如何對草藥中活性成分進行定性和定量。對白毛茛而言，為了質量控制的需要，必須建立一個快速、高質量、等度洗脫的分析方法來鑒定和測定生物堿的種類和含量。

　　Betz^[5]，Anderson和Burney^[6]等在以前的工作中已經通過常溫萃取后用高效液相色譜法測定了H. canadensis中的生物堿含量。除了快速測定白毛茛中主要生物堿以外，人們還需要新的方法來測定非洲防已堿。非洲防已堿可用作標記物來區分白毛茛和其他含黃連素的植物。我們用Zorbaxrapod-resolution Eclipse XDB-C18色譜柱(Agilent Technologies，Palo Alto，CA，U．S．A．)， 以醋酸氨緩沖液和乙腈為流動相，測定了白毛茛中主要的生物堿和非洲防已堿。該方法能夠得到理想的分辨率和峰形，滿足以上要求，而且還能夠用于其他含黃連素植物的分析。

　　Zorbax Eclipse色譜柱非常適合研究中使用的乙睛／水流動相的中度pH環境(4．85)。在該pH值下，硅膠表面殘留的硅逐基可以電離，與生物堿中帶正電的含氮基團發生離子交換，從而導致色譜峰的展寬和拖尾，降低了分辨率。為了避免這一問題，對Eclipse色譜柱的硅膠表面殘留的硅經基進行了封尾，使其電離減至最小。

　　該色譜柱另一個特性是它采用了金屬含量很低的高純硅膠。硅膠中的金屬雜質不但能夠促進硅經基的電離，而且與流動相中的分析物相互作用，影響分離。總的看來，填料的這些改進提高了色譜柱的使用壽命。實現了6種生物堿的高分辨分離，峰形良好。

2 實驗部分

　　 樣口的提取

　　樣品的提取步驟如下：(1)稱取約0．5g白毛茛根粉末；(2)加入100mL乙腈：水：磷酸(體積比為70：30：0．1)的混合溶液溶解樣品粉末；(3)超聲5min，振蕩(搖床)10min，離心過濾；(4)濾液用乙腈：水(體積比為30：70)的混合溶液稀釋5倍；(5)將樣品溶液注入液相色譜儀進行分析。

3結果與討論

　　優化后的色譜分離圖見圖3。如圖所示，重現性非常好。分離溫度穩定在30℃，能夠保證重現的保留時間^[7]。 
 

　　該方法也被用來評價提取步驟的合理性。表1列出了線性關系、精密度和生物堿的回收率。生物堿的精密度和92％一102％回收率都非常好，能夠用于定量測定。線形回歸結果、靈敏度也不錯(見圖4)。根據標準曲線計算出黃連素的檢出限和定量限分別是0．50mg／mL和1．65mg／mL。這一結果表明：即使在白毛茛提取物質量濃度很低的情況下，該方法也能夠對生物堿進行高精密度的定量分析。 

　　表2列出了來源于5個不同供應商的9批白毛茛粉末的生物含量測定結果。結果表明：在不同供應商提供的樣品中生物堿的含量存在明顯的差異，因此發展該分析方法是非常必要的。

4 結論

　　隨著非處方藥物中天然產物使用范圍的擴大，草藥或者植物藥質量控制和質量標準化引起了人們的廣泛關注。質量控制和標準化涉及到藥物成分的穩定性和一致性，確保公眾不受假藥和非法有害藥物的侵害。白毛真是眾多草藥的一個代表，提取工藝和高效液相色譜分離是建立在分析方法的基礎上的。

　　當前，人們已經利用高分辨zorbax色譜柱(選擇合適的pH值和流動相)發展了多種液相色譜方法，并將常溫提取／液相色譜分離的分析方法應用于許多草藥如人參小連翹屬植物，也用于很多有重要生物活性的植物成分，如黃酮、二氫黃酮和酚酪、植物雌激素和異黃酮、花青素。更多的分析方法正在發展中(見補充報道)。

補充報道

　　醫學知識的發展，信息渠道的多樣化和自我意識的增強促使人們開始轉向傳統藥物以外的領域去尋找治療和保健的新藥。在美國，一大批高素質的、富裕的人群即將進入退休年齡，這一現狀更增加了新藥開發的動力。

　　新藥研究一個很重要的領域是已經使用了幾個世紀之久的植物藥，它們已被證明對許多疾病有療效。在很多時候，支持使用植物藥的觀念與基于現代藥物的科學準則是不一致的。這一區別造成兩種思維之[日的障礙。不過，新藥或替代藥研究催生了一個新的產業，它們將天然產物作為飲食類補品和／或飲食療法。這一產業所占有的市場已經達到157億美元^[8]，但隨之而來的監管不利、危險物質超標、假藥泛濫等問題促使美國和其他國家采取措施保護公眾健康。

　　國家研究院下屬的藥品、食品和營養品研究所提交了關于這一問題的官方報告。在它的支持下，飲食補品成分安全評價委員會正在建立一個體系以供美國食品藥品管理局評價飲食補品的安全性。在這些目標中，該體系包括一個科學有效測定飲食成分的歸類系統^[9]。考慮到基于同一天然產物不同品牌的產品間成分差異較大，以及不同分析方法可能造成的產品組成的差異，該體系最后會使用統一的分析標準^[10]。這就是Agnent Technologies和它的用戶們致力于建立植物藥和其他領域的標準分析方法的最終目的。

參考文獻:

1. Weber HA, Joseph M.Extraction and HPLC analysis of alkaloids in goldenseat. Palo Alto,CA: Agilent Technologies. Applic note 5988-7136 EN, SeIJt 18, 2002.
   
2. Weber HA, Zart MK, Hodges AE, et al. Method validation for determination of alkaloid content in gotdenseal root powder. J AOAC Int 2002;86:476-83.
   
3. Herbal Information Center. www.kcweb.com/herb/goldenseal.htm.
   
4. Herbalist Review. Issue 2000 (3). TCM paradigm and Western herbs, Oregon Grape.www.rmhiherbal. org/review/2000-3.html.
   
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6. Anderson ML, Burney DP. J AOAC Int t998;81:1005-IO.
   
7. Weber HA, Zart MK, Ferguson SL, et al. J Liq Chromatogr Rel Tcch 2001 ; 24(I):87-95.
   
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