懸滴中的生物分析化學

聲學懸浮儀能簡化單個顆粒或單個液滴的各種測量。把液滴或顆粒懸浮在固定超聲波的節點上。避免了分析樣品時由于手觸及容器壁可能引起的任何干擾。在脂肪化合物的研究過程中說明了懸浮液的使用。研究脂類分解的啟始和終止時間時，實驗很迅速(通常60?120s)。該技術特別適合以單細胞水平研究自然環境中的動態過程。非擴散檢測技術使用了結合有成像技術的熒光光譜。

The acoustic levitator facilitates a variety of measurements on single panicles or single drops of liquid. The drops or panicles are levitated at the nodal points of a standing ultrasonic wave, thus eliminating any interference that might arise from the walls of a container used to handle and analyze the sample. The use of the levitation instrument is illustrated in a study of adipocytes. Experiments are fast (usually 60-120 sec) during which time both the activation and inhibition of lipolysis are studied. The technique is particularly suited for the study of dynamic events in nanlral environments at the single cell level. Noninvasive detection techniques employ nuorescence spectroscopy combined with imaging.

        近年來，對于能夠滿足在細胞和亞細胞水平進行生物學研究的分析技術的需求日益增長^[1]。盡管目前人們已能夠對單個的原子或分子進行計數，但處理單個細胞階情況要復雜得多^[2]。由于復雜的混合組分同時存在，可能對目標測量結果產生干擾。分辨足夠量的潛在干擾與分析物是關鍵所在。可用于解決這個問題的一種方案是在進行真正的分析測試(如：毛細管電泳，一種以適于生物和小量樣品著稱的技術)之前先進行化學分離^[3]。可是伴隨著小型化的主要問題是，用于處理和分析樣品裝置的非特異性吸附，以及由周圍器壁導致的光學干擾^[4]。因此未來這一領域對分析儀器開發的要求將圍繞對器壁的改進問題。

　　作者為解決這一問題所作的研究是應用懸滴技術。聲學懸滴儀很容易實現對單個顆粒或懸滴的各種研究，懸滴能夠被懸浮于超聲波的節點。這種方法可以將懸浮物體固定在一特定的位置，除了其周圍的媒體(通常為空氣)之外，這種研究不受任何接觸表面的干擾^[4，5]。可以將活細胞置于這種懸浮液滴中，采用特殊設計的分散器引入不同的物質加以研究，細胞對這些物質的響應可以通過熒光成像技術監測^[6]。試驗儀器裝置如圖1所示。

　　完成單細胞分析的能力是非常重要的。單細胞分析不僅能夠用于研究細胞群中細胞的同質性和年齡，探討細胞的物理特性與其化學組成之間的關系，也可以確定細胞群體相對于單個細胞的協作效應。

　　單細胞研究對于臨床診斷和治療具有重要意義，因為通過將細胞分開來檢測，會使發現非正常細胞的機會增多。對于健康的細胞和生病的細胞，藥物的攝取量可能差別很大，對于這種多變性的認識，可能對了解復雜細胞環境中的細胞功能和完善藥物的設計及控制藥物的副作用有利^[7]。

　　在人體中，細胞處于細胞外部分子的恒定影響下，所有細胞外部分子都會通過與細胞表面受體的作用而影響細胞的行為。這些分子包括配體、細胞內生的物質和細胞外基體蛋白質。配體導引細胞表面通過血流(如荷爾蒙、生因子、胞漿)，細胞內產生的物質對相鄰細胞產生影響。在我們身體的細胞中包含內部通信網絡，只有細胞之間的通信正常，身體的功能才能正常。一個細胞中的信號傳輸起始于信使分子(如荷爾蒙)。它與細胞表面的受體分子結合，細胞通過特殊的信號通道，將信使分子的命令傳輸到響應和完成任務的分子。例如，在機體需要能量的時候，脂肪細胞對β-腎上腺素響應后將游離脂肪酸和甘油釋放到血液中(圖2)^[8]。

1 實驗

　　實驗裝置如圖3所示。超聲波發生器來自Dantec／invent Measurement Technology GmbH(Erlangen，Germany)。在超聲波發生器產生的超聲波場中，包含有活細胞的緩沖溶液液滴被懸浮起來。通過特殊設計的自制液滴分散器，將不同的物質加入到包含有細胞的懸浮液滴中，細胞通過熒光成像檢測監控。β-腎上腺素的加入啟動脂肪動員激素的脂解作用，導致質子的釋放，使周圍緩沖溶液的pH變化，而胰島素對抗這種影響，也會導致pH的降低。去甲腎上腺素由Sigma公司提供，人胰島素來自Novo Nordisk(Gentofte，Denmark)。小液滴的蒸發作用會對熒光強度產生影響。為了抵消這種作用，采用分配器連續加水，以保證小液滴體積不變。將HPTS用于pH監控，汞燈和光導纖維用于提供435：405nm比率的激發光，發射光在510nm處檢測。帶有1100 x 330像素的CCD相機用于收集小液滴的圖像。小液滴的積分強度通過對圖像中所有像素強度加和得到。本底校正程序采用Matlab編制(The MathWorks Inc.，Natick，MA)。

2 結果與討論

　　通過對活細胞內部信息系統的開發，采用包含活細胞的懸浮液滴對脂肪細胞的反應加以研究已有報道^[6]。圖4a給出了脂解期間單一脂肪細胞的熒光強度LC，及不包含脂肪細胞時的空白小懸浮液滴的對照結果。圖4b給出了12個脂肪細胞脂解反應的啟動和終止過程。可以通過任意數量的細胞完成分析。懸浮液滴方法的優點之一是實驗耗材少，如只需極少量細胞、試劑等。另一方面，由于無接觸表面，防止低濃度化合物在裝置器壁上的吸附。實驗速度很高，對于脂肪細胞的激活和抑制的研究可以在60到120s內完成，試驗所需總時間主要取決于細胞的類型、候選藥物的種類和所研究的反應類型。

　　因為我們要檢測整個懸浮液滴免受不必要的干擾，所以采用遠程監測的方案是非常重要的。將熒光光譜或成像技術相結合，是非介入檢測的有力工具。這種方法特別適用于在單細胞水平研究自然細胞的環境和動力學活動，如對于新藥的篩選、藥物副作用的研究及對細胞之間反應的探討。該系統也可以用于研究不同種類細胞如脂肪細胞和β-細胞之間的通訊^[9]。在活細胞體系中所研究的物質通常有β-腎上腺素、β-阻斷劑、β_3-相互作用物及類胰島素等藥物。由于所需細胞量很少，用此種方法可以減少新藥示蹤過程所需的動物數量，也可以用于分析活體解剖或從骨髓中獲取活細胞。例如，在癌癥診斷中，用于分析單個活細胞并比較它們與那些受控細胞的反應。

　　懸滴技術可用于毛細管電泳分析前的樣品富集，這在前文已得到證實^[5]。將懸浮小液滴進樣到毛細管中，并進一步用于毛細管電泳分析也是可能的，它還可能用于分析在懸浮液滴中加入藥物后的細胞組成。未來的研究將集中在將懸滴中的脂解反應控制在不同的活性階段，然后將其注入到毛細管中以進行下一步毛細管電泳分析。這種方法可以測得由于某種刺激引起的細胞內的變化。

參考文獻:

1. Chen G, Ewing AG. Chemical analsis of single cells and exocytosis. Crit Rev Neurobiol 1997; 11(1):59-90.
   
2. Jaleway SC, de Mello AJ, Russell EL. Miniaturized total analysis systems for biological analysis. Fres J Anal Chem 2000;366:525-39.
   
3. Yeung E. Study of single cells by using capillary electrophoresis and native nuorescence detection. J Chromatogr A 1999;830:243-62
   
4. Welter E, Neidhart B. Acoustically levitated droplets-a new tool for micro and trace analysis. Fres J Anal Chem 1997;357:345-50.
   
5. Petersson M, Nilsson J, Wallman L, Laurell T, Johansson J, Nilsson S. Sample enrichment in a single levitated droplet for capillary electrophoresis. J Chromatogr B 1998;714:39-46
   
6. Santesson S, Andersson M, Degerman E, Johansson T, Nilsson J, Nilsson S. Airbome cell analysis. Anal Chem 2000;72:3412-8.
   
7. Yeung ES. Chemical analysis of single human erythrocytes. Acc Chem Res 1994;27:409-14.
   
8. Degerman E, Rahn Landstr6m T, Wijkander J, et al.Phosphorylation and activation of hormone-sensitive adipocyte phosphodiesterase type 3B. Methods: ACompanion to Meth in Enzymol 1998;14:43-53.
   
9. Eliasson L, Renstrom E, Ding WG, Proks P, RorsmanP. Rapid ATP-dependent prlming of secretory granulesprecedes Ca2+ -induced exocytosis in mouse pancreatic B-cells. J Physiol 1997;503(2):399-412.