經驗：一步法Tunel 細胞凋亡檢測

　　使用說明：

　　1. 對于貼壁細胞或細胞涂片：

　　a. PBS或HBSS洗滌一次。

　　b. 如果細胞貼得不牢，可以干燥樣品使細胞貼得更牢。

　　c. 用4%多聚甲醛或碧云天生產的免疫染色固定液(P0098)固定細胞30-60分鐘。

　　d. 用PBS或HBSS洗滌一次。

　　e. 加入含0.1% Triton X-100的PBS或碧云天生產的免疫染色洗滌液(P0106)，冰浴孵育2分鐘。

　　f. 轉步驟5。

　　2. 對于懸浮細胞或細胞懸液：

　　a. 收集細胞(不超過200萬細胞)，PBS或HBSS洗滌一次。

　　b. 用4%多聚甲醛或碧云天生產的免疫染色固定液(P0098)固定細胞30-60分鐘。為防止細胞聚集成團，宜在側擺搖床或水

　　平搖床上緩慢搖動的同時進行固定。

　　c. 用PBS或HBSS洗滌一次。

　　d. 用含0.1% Triton X-100的PBS或碧云天生產的免疫染色洗滌液(P0106)重懸細胞，冰浴孵育2分鐘。

　　e. 轉步驟5。

　　3. 對于石蠟切片：

　　a. 二甲苯中脫蠟5-10分鐘。換用新鮮的二甲苯，再脫蠟5-10分鐘。無水乙醇5分鐘。90%乙醇2分鐘。70%乙醇2分鐘，蒸

　　餾水2分鐘。

　　b. 滴加20μg/ml不含DNase的蛋白酶K，在20-37℃作用15-30分鐘(不同組織的最佳作用溫度和時間需自行摸索)。

　　c. PBS或HBSS洗滌3次。注意：這一步必須把蛋白酶K洗滌干凈，否則會嚴重干擾后續的標記反應。

　　d. 轉步驟5。

　　4. 對于冷凍切片：

　　a. 用4%多聚甲醛或碧云天生產的免疫染色固定液(P0098)固定細胞30-60分鐘。

　　b. PBS或HBSS洗滌2次，每次10分鐘。

　　c. 加入含0.1% Triton X-100的PBS或碧云天生產的免疫染色洗滌液(P0106)，冰浴孵育2分鐘。

　　d. 轉步驟5。

　　5. 配制TUNEL檢測液：

　　參考下表配制適當量的TUNEL檢測液，需充分混勻。注意：配制好的TUNEL檢測液必須一次使用完畢，不能凍存。

　　1個樣品5個樣品10個樣品

　　TdT酶 2μl 10μl 20μl

　　熒光標記液48μl 240μl 480μl

　　TUNE檢測液50μl 250μl 500μl

　　6. 對于貼壁細胞、細胞涂片或組織切片：

　　a. 用PBS或HBSS洗滌2次。

　　b. 在樣品上加50μl TUNEL檢測液，37℃避光孵育60分鐘。注意：孵育時需注意在周圍用浸足水的紙或藥棉等保持濕

　　潤，以盡量減少TUNEL檢測液的蒸發。

　　c. PBS或HBSS洗滌3次。

　　d. 用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察。可以使用的激發波長范圍為450-500nm，發射波長范圍為515-

　　565nm(綠色熒光)。

　　7. 對于懸浮細胞或細胞懸液：

　　a. 用PBS或HBSS洗滌2次。

　　b. 加入50微升TUNEL檢測液，37℃避光孵育60分鐘。

　　c. PBS或HBSS洗滌2次。

　　d. 用250-500微升PBS或HBSS懸浮。

　　e. 此時可以用流式細胞儀進行檢測或涂片后在熒光顯微鏡下觀察。可以使用的激發波長范圍為450-500nm，發射波長的

　　范圍為515-565nm(綠色熒光)。

 

 

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