吸附固定相電色譜和動態改性電色譜的手性分離

　　很多手性藥物的不同對映體有不同的藥效,美國食品和藥物管理局規定,今后凡發展具有不對稱中

　　心的藥物,必須給出手性拆分的結果.對手性藥物分離分析技術的需求是制藥工業面臨的重要挑戰之

　　一.電色譜綜合了毛細管電泳和高效液相色譜的優越性,具有高效,快速,選擇性強,運行成本低等優

　　點.電色譜在手性拆分方面也有廣泛的應用前景.Mayer等〔1〕在毛細管壁涂布環糊精,率先進行了開管

　　電色譜手性分離實驗.此后,電色譜手性分離的研究越來越多〔2〕.在國內,魏偉等〔3〕通過在流動相中添

　　加羥丙基環糊精,在硅膠填充柱電色譜中成功地分離了兩對堿性藥物異構體.朱軍等〔4〕利用β2CD填充

　　柱色譜柱分離了安息香,美芬妥因等手性化合物.劉震等〔5 ,6〕通過在毛細管管壁吸附堿性蛋白,肽等,

　　用開管電色譜模式分離了一些手性化合物.

　　動態改性電色譜(DMS2CEC) 是最近由我們發展出來的一種電色譜模式〔7 ,8〕.它是在流動相中添加

　　少量改性試劑,主要是一些離子性的表面活性劑,這些改性試劑動態地吸附于填料的表面,形成一層準

　　固定相.在DMS2CEC中的溶質主要根據本身的電泳淌度及與準固定相的相互作用而得以分離.本實

　　驗采用磺化的β2CD作為改性試劑,對強陰離子固定相(SAX)進行動態改性,動態吸附于SAX填料表面

　　的β2CD形成一層手性固定相,從而使本系統具有手性拆分能力.此外,在SAX填料表面直接物理吸附

　　蛋白質和磺化β2CD進行手性分離也進行了嘗試,并比較了物理吸附和動態吸附磺化 β2CD的優缺點.

　　2 實驗部分

　　211 儀器和材料

　　P/ ACE MDQ型毛細管電泳儀(Beckman公司).乙腈,甲醇為色譜純試劑,水為二次去離子水.5μm

　　粒徑的強陰離子交換固定相(SAX) (美國的Water Phase Separation公司);內徑為50μm的毛細管(河北永

　　年光纖廠);牛血清白蛋白(BSA)購自華美公司,色氨酸(中國科學院上海生物化學研究所),其它手性試

　　劑(Sigama公司).磺化的β2CD(S2CD) (Aldrich公司),其磺化率為7～11.本文涉及的手性樣品的結構

　　式如下:

　　212 電色譜的制備

　　采用勻漿法填充 SAX電色譜柱,其裝柱過程見文獻〔7 ,8〕.SAX電色譜柱的總長為31 cm ,填充柱

　　長 10 cm.將BSA吸附于SAX固定相上的方法與文獻〔10〕相似.將SAX電色譜柱裝上電泳儀后,利用

　　其壓力系統,在 345 KPa下先用50 mmol/ L和10 mmol/ L磷酸緩沖液(pH 6. 8)各沖洗30 min ,用2 g/ L BSA

　　的磷酸緩沖溶液(10 mmol/ L ,pH 6. 8沖洗7～8 h ,接著用50 mmol/ L磷酸緩沖溶液(pH 6. 3)沖洗6 h ,用1

　　mmol/ L的磷酸緩沖溶液(pH 6. 3)沖洗30 min ,最后用5 kV和10 kV電壓各平衡1 h.在進行手性分離中

　　流動相不含BSA.

　　SAX電色譜先用含10 %甲醇,20 mmol/ L乙酸2三乙胺(pH 4. 0),2. 0 g/ L S2CD的流動相平衡1 h ,使

　　S2CD吸附于 SAX填料.然后,改用不含S2CD的流動相平衡30 min ,進行吸附S2CD柱手性分離.在動

　　態改性電色譜實驗中,電色譜柱直接用含S2CD的流動相平衡30 min后進行實驗.

　　213 色譜條件

　　分離電壓設為10kV或15 kV ,電動進樣3kV×5s ,檢測波長為214 nm ,溫度為25℃.

　　3 結果與討論

　　311 吸附固定相電色譜手性分離

　　最近,劉震等〔7 ,8〕將堿性蛋白,肽等吸附于毛細管管壁,成功的進行了開管電色譜手性分離實驗.

　　實際上,在液相色譜中也可以將蛋白質吸附于硅膠,離子交換等載體上,進行手性分離〔9 ,10〕.但這種方

　　法尚未在填充電色譜中得到應用.本工作將BSA 吸附于SAX固定相上進行手性分離,圖1所示為SAX

　　固定相吸附BSA前后分離色氨酸的電色譜圖.在蛋白質吸附之前,只出一個峰說明此時該柱沒有手性

　　拆分能力,而吸附蛋白以后,D型和L型色氨酸獲得較好的分離,分離度達3186.D型色氨酸由于與

　　BSA的相互作用小,比L型先出峰.實驗中發現SAX固定相在吸附蛋白質前后,電滲流的方向沒有改

　　變.其原因可能是SAX吸附蛋白質還沒有達到飽和,填料表面仍然以正電荷為主.蛋白質吸附于SAX

　　填料表面,其色譜分離的穩定性是關鍵因素之一.以5 %乙睛,2 mmol/ L的磷酸緩沖溶液(pH 6. 3)為流

　　動相對其重現性進行了考察.連續運行16次,結果表明死時間和D型,L型色氨酸的遷移時間重現性

　　比較好,它們的相對標準偏差(RSD)分別為015 %,0153 %和0181 %.這說明吸附在填料表面的BSA不

　　易被洗脫.D型和L型色氨酸的平均柱效分別為40 ,110和12 ,835理論塔板數/米,柱效比較低.

　　SAX填料吸附S2CD后也有手性分離能力,圖2是分離D,L色氨酸的譜圖.由于分離機理不同,色

　　氨酸異構體在吸附蛋白質柱上和吸附S2CD柱上的出峰順序不相同.在吸附蛋白質柱上,由于L型色

　　氨酸與BSA作用力強,D型先于 L型出峰,而在吸附S2CD柱上則相反.吸附S2CD的柱效較高,D型和

　　L型色氨酸的平均柱效分別為71 ,000和66 ,000理論塔板數/米.但由于選擇性比較差,分離度比吸附

　　蛋白質低,為2. 97.SAX填料本身帶正電,電滲流應該從負極流向正極,但在實驗中發現SAX填料吸附

　　S2CD后,電滲流方向相反.這主要是由于SAX填料表面的正電荷被S2CD中的部分磺酸基所中和,而另

　　一側的磺酸基使填料表面帶負電,從而導致電滲流反向.對吸附S2CD柱電色譜分離色氨酸的重現性也

　　進行了考察.在流動相為10 %甲醇,20 mmol/ L乙酸2三乙胺(pH 4. 0)和分離電壓為10 kV下連續運行

　　17 次,死時間,L型和D型的出峰時間的RSD分別為1115 % ,913 % ,913 % ,重現性比吸附蛋白質固定相

　　差.實驗表明,死時間隨著運行次數的增加而增加,其原因是由于吸附在填料上的S2CD隨著運行時間

　　的增長而流失,導致填料表面凈負電荷減少,從而使電滲流減小.由于電泳機理的參與,液相色譜中保

　　留因子已不足以表征帶電樣品在CEC中的遷移行為,為此定義電色譜保留因子(k3)〔11 ,12〕:k3=(tr-

　　003 分析化學第29卷

　　t0)/t0,式中t0和tr分別為死時間和樣品的遷移時間.實驗結果表明,在吸附 S2CD電色譜中,色氨酸異

　　構體的k3隨著運行次數的增加而減小,這也說明S2CD的流失,從而使色氨酸在柱中的保留減小.由此

　　可見,與蛋白質相比,S2CD更容易從SAX填料上脫附,吸附S2CD電色譜重現性比吸附蛋白質固定相電

　　色譜更差.

　　圖1 強陰離子交換電色譜柱在固定相(a)不吸附和

　　(b)吸附BSA時分離色氨酸的譜圖

　　Fig. 1 Chromatograms for separation of tryptophan in strong

　　anionic exchange capillary electrochromatography(CEC)with

　　stationary phase(a)without adsorption and(b)adsorption of

　　bovine serum albumin(BSA)

　　實驗條件 (experimetanl condition):電色譜柱總長(total length of

　　capillary column)31 cm ;填充柱長(packed column length): 10 cm ;內

　　徑(I. D.)50μm ;填料(packing),5μm SAX ;流動相(mobile phase),1

　　mmol/ L的磷酸緩沖溶液(phosphate buffer);分離電壓(separation

　　voltage), 10 kV ;進樣(injection), 5kV×2s ;檢測波長(detection

　　wavelength),214 nm ;溫度(temperature),25℃.樣品(solute),色氨

　　酸(tryptophan).

　　圖 2 S2CD吸附柱電色譜分離色氨酸的色譜圖

　　Fig. 2 Chromatogram for separation of tryptophan in adsorbed

　　sulfated2β2cyclodextrin(S2CD)CEC

　　實驗條件 (experimental condition):流動相含10 %甲醇,20 mmol/

　　L乙酸/三乙胺(pH 4. 0) (mobile phase contained 10 % methanol , 20

　　mmol/ L acetic acid/ triethylamine(pH 4. 0).其它條件同1(other

　　conditions were the same as that in Fig. 1).

　　圖3 動態改性電色譜分離色氨酸,阿托品和異博定的

　　譜圖 Fig. 3 Enantiomer separation of tryptophan , atropine and

　　verapamil in a single run in dynamically modified stationary

　　phase(DMS2CEC)

　　實驗條件(experimental condition):流動相含30 %甲醇,20 mmol/

　　L乙酸/三乙胺(pH 4. 0)和2 g/ L磺化CD分離電壓(the mobile

　　phase contained 30 % methanol , 20 mmol/ L acetic acid/ triethylamine

　　(pH 4. 0)and 2 g/ L S2CD)15 kV.其它條件同1(other conditions

　　were the same as that in Fig. 1).樣品(solutes): 11L2色氨酸(L2

　　tryptophan);21D2 色氨酸(D2tryptophan);3和41阿托品對映體(3

　　and 4 enantiomers of atropine); 5和61異博定對映體(5 and 6

　　enantiomers of verapamil).

　　312 動態改性電色譜手性分離

　　固定相的流失是吸附固定相電色譜的致命弱

　　點,是其重現性差的主要原因.動態改性電色譜與

　　吸附固定相電色譜的區別主要表現在流動相的組成

　　上.在動態改性電色譜中,在流動相中添加一定濃

　　度的被吸附物質,經過一段時間的平衡后,這些物質

　　在流動相和固定相中達到平衡,因此被吸附于固定

　　相中的物質不會因為運行時間增加而流失,所以動

　　態改性電色譜可以獲得較好的重現性.在以SAX

　　固定相為填料的電色譜中,于流動相添加2 g/ L S2

　　CD ,平衡一段時間后,進行色氨酸分離.連續運行

　　17次,t0基本上不隨運行次數的增加而增大,其

　　RSD為0. 53 % ,k3也沒有明顯的下降趨勢,對映體

　　的k3的RSD分別為0. 62 %和0. 69 %.與吸附磺化

　　CD電色譜相比,動態改性電色譜有更好的重現性.

　　其原因是由于動態吸附于填料表面的磺化CD不隨運行次數的增加而減少.

　　圖3所示為在一次運行中分離色氨酸,阿托品和異博定的譜圖.流動相中含30 %甲醇,20 mmol/ L

　　乙酸/三乙胺(pH 4. 0)和210 g/ L S2CD.色氨酸的等電點為5189 ,阿品托和異博定為堿性藥物,在pH 4.

　　103第3期葉明亮等:吸附固定相電色譜和動態改性電色譜的手性分離

　　0時都帶正電,在電場的作用下,應該移向負極.吸附S2CD后,SAX填料表面帶負電,電滲流也流向負

　　極. 樣品的電泳方向與電滲方向一致,樣品應該在t0之前出峰,但由圖3可見,樣品峰都在t0峰之后出

　　現.這說明樣品分子與固定相之間有很強的相互作用.由于填料表面帶負電,離子交換機理勢必影響

　　樣品的遷移,這可能是樣品在本系統中保留強的主要原因,但是無論是溶質本身的電泳遷移機理,還是

　　與吸附固定相的離子交換機理,都不能使對映體分離.手性化合物之所以能在本系統中得以分離,主要

　　是由于對映體與吸附于填料表面的S2CD之間形成包結絡合物的能力不同造成的.圖3中各峰的柱效

　　介于85 ,000和412 ,000塔板數/米之間,柱效遠比以β2CD為填料的電色譜要高〔4 ,13〕.在離子交換電色

　　譜中往往能取得高柱效,本實驗高柱效的取得可能也與離子交換機理有關.圖3中色氨酸,阿托品和異

　　博定對映體間的分離度分別為2106 ,1011和1196 ,分離效果很好.

　　References

　　1 Mayer S , Schuring V J .High.Res.Chromatogr. ,1992, 15(2):129～131

　　2 Hatajik T D , Brown P R.J.Cap.Elec. ,1998, 5(3/ 4):143～151

　　3 Wei W , Lou G , Xiang R , Yan C.J.Micro.Sep. ,1999, 11(4):263～269

　　4 Zhu J un(朱 軍), Zou Hanfa(鄒漢法), Shi Wei(施 維), Rui Jianzhong(芮建中), Ni Jianyi(倪堅毅), Zhang Yukui(張玉

　　奎).ScienceinChina,SeriesB(中國科學(B輯) ),1999, 29(5):418～425

　　5 Liu Z , Zou H , Ni J , Zhang Y.Anal.Chim.Acta,1999, 378(1):73～76

　　6 Liu Z , Zou H , Ni J , Zhang Y.Electrophoresis,1999, 20(14):2891～2897

　　7 Ye M Zou H , Liu Z , Ni J , Zhang Y.J.Chromatogr.A,1999, 855(1/ 2):137

　　8 Ye M , Zou H , Liu Z , Ni J , Zhang Y.Anal.Chem. ,2000, 72(2):616

　　9 Thompson R A , Andersson S , Allenmark S.J.Chromatogr. ,1989, 465(2):263

　　10 Jacobson S C , Guiochon G.J.Chromatogr. ,1992, 590(1):119

　　11 Ye M , Zou H , Liu Z , Zhu Z , Ni J , Zhang Y.ScienceinChinese(Series B),1999, 42(6):639

　　12 Ye M , Zou H , Liu Z , Ni J .J.Chromatogr.A,2000, 869(2):385

　　13 Li S , Lloyd D K.J.Chromatogr.A,1994, 666(2):321～335

　　Chiral Separation by Capillary Electrochromatography with Physically

　　Adsorbed Stationary Phase and Dynamically Modified Stationary Phase

　　Ye Minglian , Zou Hanfa3, Lei Zhengdeng , Wu Renan , Li Jianyi

　　(NationalChromatographicResearchandAnalysisCenterDalianInstituteofChemicalPhysics,

　　ChineseAcademyofSciences,Dalian116011)

　　Abstract A novel mode of chiral separation in electrochromatography(CEC)with dynamically modified stationary

　　phase(DMS2CEC)was presented. The capillary column was packed with strong anionic exchange stationary phase ,

　　the sulfatedβ2cyclodextrin(S2CD), which was added in the mobile phase , dynamically adsorbed to the packing

　　surface and a new layer of chiral stationary phase was formed. The separation of enantiomer was based on their

　　different interaction with the new stationary phase. The enantionmers of tryptophan , atropine and verapamil were

　　successfully separated in this system with resolution of 2. 06 , 10. 1 and 1. 96 , and the column effeciency for the

　　enantiomers were varied from 85000 plates/ m to 412000 plates/ m. The relative standard deviation(RSD)of void

　　time and the tryptophan enantiomers′migration time for 17 consecutive runs were 0. 5 % , 0. 6 % and 0. 7 % ,

　　respectively. Enantiomer separation by capillary electrochromatography with adsorbed bovine serum albumin(BSA)

　　and sulfated cyclodextrin(S2CD)as chiral stationary phases were also studied. The resolution for tryptophan

　　enantiomers in the two systems were 3. 86 and 2. 97 , respectively. It was found that the superiority of DMS2CEC

　　over the adsorbed S2CD column CEC was that better repeatability could be obtained in DMS2CEC.

　　Keywords Capillary electrochromatography , dynamical modification , adsorbed stationary phase , enantiomer

　　separation