毛細管離子色譜進展

　　摘要 從毛細管離子色譜柱制備和毛細管離子色譜儀器研制兩方面評述了毛細管離子色譜目前的發展狀況。毛細管離子色譜柱包括開管離子色譜柱，毛細管顆粒填充離子色譜柱以及最近幾年發展起來的整體毛細管離子色譜柱。對毛細管離子色譜儀的總結包括微流量泵、小體積進樣器、適合毛細管離子色譜系統的小體積抑制器、電導和光學檢測器等。

　　關鍵詞 離子色譜， 毛細管液相色譜， 毛細管離子色譜， 整體柱,評述

　　1 引言

　　儀器微型化是目前分析儀器發展的重要研究方向之一。分離科學與技術的發展，特別是新材料和微制造技術的進步，極大地推進了微分離分析技術乃至其它分析儀器微型化的發展。近年來，色譜領域的微分離技術，如毛細管電泳(CE)、毛細管液相色譜(Capillary HPLC)[1]、毛細管電色譜(CEC)及微流控芯片(Labonchip)等，發展迅速，并在生物、醫藥、環境等許多領域得到了廣泛應用。色譜儀器微型化可以大大降低流動相消耗，從而降低有機溶劑對環境的污染;大大減少了樣品用量，非常適合價格昂貴、難以獲得的生物樣品以及某些有毒的環境樣品;分析速度快，裝置小，可以實現多通道同時檢測。

　　文獻[2~4]闡述了離子色譜方法的原理及應用。離子色譜主要用于無機陰、陽離子的分離分析,近些年也應用于有機酸、氨基酸、蛋白質等有機離子的分析。離子色譜最常使用的檢測器是電導檢測器，此外，紫外可見檢測器和安培檢測器也經常使用。離子色譜的主要貢獻在于對陰離子的分離分析，在離子色譜出現之前，陰離子的分析方法存在靈敏度低、操作煩瑣、不能進行多離子同時分析及穩定性、重現性差等缺點。30年來離子色譜在柱技術、抑制器、儀器自動化等方面得到了充分發展。目前，國際上已將離子色譜作為與高效液相色譜、氣相色譜和毛細管電泳并列的一種色譜方法單獨分類。

　　離子色譜儀器的微型化除了具有和其他色譜儀器微型化相同的優勢外，由于其在環境分析領域的特殊地位，微型(小型)化更適應野外環境分析的需要。目前，已有商品化的便攜離子色譜儀，將泵、柱、檢測器、流動相等全部放在便攜箱中，總重量十多kg。

　　普通離子色譜柱內徑為4~5 mm，而毛細管離子色譜柱的內徑為5~500 μm。1983年，Rokushika等[5]首次報道了毛細管離子色譜儀的研制，采用47 cm×019 mm i.d.石英毛細管柱，柱內填充10 μm陰離子交換填料，配有02 mm i.d.×10 mm中空纖維抑制器，流速19 μL/min，分離了mg/L級的無機陰離子和有機酸以及河水和果汁中的陰離子成分。Kuban等[6]總結了毛細管離子色譜的發展。但是，迄今為止，毛細管離子色譜儀及毛細管離子色譜柱尚未實現商品化。毛細管離子色譜是當今離子色譜領域的重要前沿課題，本文從柱和儀器兩個方面對目前毛細管離子色譜的發展進行綜述。

　　2 毛細管離子色譜柱

　　2.1 開管毛細管離子色譜柱

　　早在1981年開管液相色譜柱已出現，Ishii等[7]在30~60 μm玻璃毛細管內制備了開管離子交換柱，分離了4種核苷。但是，開管液相色譜柱在應用中受到一些限制。我們可以從Golay所推導的開管液相色譜的塔板高度的基本公式看到其局限性。H=2Dm[]u+(11k′2+6k′+1)d2c[]96(1+k′)2DMu+k′d2f[]3(1+k′ )2Dsu(1)式中，H為板高，u為流動相線速度，k′為容量因子，dc為色譜柱內徑，df為固定相涂層厚度，DM、DS分別為溶質在流動相和固定相的擴散速率。由于分子在液相中擴散系數要小于在氣相中的擴散系數，所以在開管液相色譜中，第二項的影響非常大。

　　可以看出，塔板高度隨柱直徑的增加而增加，柱內徑降低才會獲得高柱效。開管柱要獲得比相同長度的填充柱更高的柱效，其內徑需要控制在2~10 μm。Muller等[8]制備了內徑46~95 μm的開管柱，46 μm i.d.×90 cm的開管柱柱效可達246 000~680 000塔板，分離了堿金屬和堿土金屬。之后，他們[9]使用46 μm i.d. 開管柱，流速為10~26 nL/min，進樣量為10 pL，25 s內分離堿金屬和堿土金屬，35 s內分離常見陰離子。從式(1)可見，為了減小流動相傳質阻力，在使用開管柱時應加大擴散系數，即采用較高的柱操作溫度和使用低粘度的流動相。Pyo等 [10]通過提高溫度，以提高樣品的擴散系數和分離效率，開管柱內徑50 μm，柱溫120~150℃，對陰離子的分析表明，柱溫從室溫增加到150℃，柱理論塔板數增加6倍。

　　開管離子色譜柱滲透性好，柱壓低，可以制備很長的色譜柱。但是，開管離子色譜柱具有很小的內體積，由于柱容量小，進樣量受到限制，pL級的進樣量以及nL/min的流速都對儀器的硬件系統有太高的要求。因此，這方面的研究不多;開管柱盡管起步較早，但一直發展不快，而填充毛細管離子色譜柱容量大，技術上的限制較小。

　　2.2 填充毛細管離子色譜柱

　　Takeuchi等[11]對填充毛細管離子色譜柱進行了深入細致的研究。由于采用毛細管柱可以大大節省流動相的消耗，在動態改性固定相方法研究中，研究費用可以大大降低。Takeuchi等[11]采用032 mm i.d.柱，以表面涂覆溴化十六烷基三甲銨的3 μm ODS為固定相，流動相含有5%的1 mmol/L水楊酸鈉，間接紫外檢測分析無機陰離子。Hu等[12] 提出靜電離子色譜，將兩性膠束膽汁酸鹽(NaTDC)涂覆在反相色譜填料上，使用純水為流動相，用于毛細管離子色譜分析。之后，他們采用該方法，在 035 mm i.d.×50 mm毛細管內填充NaTDC膠束涂覆ODS固定相。以CuSO4為流動相，紫外光度檢測同時測定了S2O2-3、NO-3、I-、SCN-、Na+和K+ 等陰、陽離子[13]。Takeuchi等[14]將牛血清白蛋白(BSA)固化到5 μm的ODS填料上，填充到035 mm i.d.毛細管柱中，流動相為NaCl和酒石酸。當流動相pH值降低時，更多的 BSA質子化，陰離子的保留增加，間接紫外檢測分析了Cl-、NO-2和Br-,并應用于自來水的分析。 他們在035 mm i.d.×50 mm硅膠柱上采用氯化芐基三甲銨(BTMAC)做流動相，采用含2 mmol/L BTMAC的30%乙腈水溶液，分離了堿金屬陽離子，應用于威士忌酒和番茄醬中陽離子的測定[15]。采用吸附能力更強的1,1′二甲基4,4′聯吡啶鹽為流動相，間接紫外測定Mg2+和Ca2+，用于飲料和紅酒分析[16]。

　　Takeuchi等在032 mm i.d.×100 mm柱內分別填充硅膠表面涂覆含有離子基團的糖類軟骨素硫酸鹽(含有—COOH，—CH2OSO3H，—NHCOCH3基團)[17]、涂覆肝磷脂(含有氨基磺酸、羧酸、磺酸基團)[18]，考察了陰、陽離子的保留行為[19];在柱內填充右旋糖苷涂覆的固定相，以CuSO4和三吡啶釕 ruthenium tris(bipyridyl)3+為流動相，分析血清樣品中的堿金屬和堿土金屬[20];采用032 mm i.d.，填充ODS的毛細管柱，流動相中加入8羥基喹啉，8羥基喹啉可以與Mg和Al絡合，絡合產物用熒光檢測[21]。文獻[22]使用032 mm i.d.毛細管，填充陰離子交換填料，5 mmol/L Na2SO4為流動相，206 nm直接紫外檢測NO-2和NO-3。

　　2.3 整體毛細管離子色譜柱

　　整體柱是近些年發展起來的一種新型分離介質，被譽為第四代色譜填料。整體色譜柱是在色譜柱內通過原位聚合而制成的連續床固定相。這種色譜柱不需用細粒徑的填料填裝，具有制備簡單、滲透性好、傳質速度快、避免燒塞子及易于改性等優點。整體柱一經推出即受到色譜領域的高度重視，近些年發展很快，已應用于蛋白質、氨基酸、低聚核苷酸、類固醇、芳烴以及聚合物等物質的分離分析。到目前為止，國內外已有多篇綜述介紹整體柱的研究 [23~26]。

　　整體柱主要分為有機聚合物整體柱和無機硅膠整體柱。聚合物整體柱由于制備過程簡單，選材范圍廣，適用的pH 范圍寬，在近幾年得到了迅速發展。但聚合物整體柱也存在溶脹、受熱變形以及機械性能差等不足，并且孔徑及孔徑分布難以控制。制備有機聚合物整體柱，往往是柱的滲透性與柱效不能兼顧，即柱孔徑小時滲透性差，但柱效高;而孔徑大時雖然滲透性好，柱效卻降低了。硅膠整體柱在孔徑控制、機械性能、耐溶劑等方面顯示出一定的優越性，但存在適用pH范圍窄，制備復雜等局限性。

　　目前離子色譜整體柱大多是在常規尺寸(46 mm i.d.)的商品無機硅膠整體柱上進行修飾，用于無機陰、陽離子的分離分析。硅膠整體柱具有很大的通孔，柱滲透性好，可以使用高流速而柱效并沒有顯著的降低，因此在快速分離中具有很大的優勢。Hatsis等[27]在Merck公司的Chromolith Speed ROD RP18e硅膠基質整體柱(50 mm×46 mm i.d.)表面涂覆溴化十二烷基二甲銨(DDAB)，流速10 mL/min，30 s內分離7種陰離子。Xu等[28~30]近幾年對整體柱在離子色譜領域的應用進行了一些研究。Paull等[31]綜述了整體柱在離子色譜領域的應用。但是，在毛細管內制備硅膠整體柱用于離子色譜分析的報道很少。Motokawa等[32]在50~200 μm i.d.毛細管內制備了多孔硅膠整體柱，高速離子色譜測定酸度。

　　相對于硅膠整體柱，有機聚合整體柱制備簡單。Yuji等[33]報道在250 μm 內徑毛細管內原位聚合有機整體柱，分離了一價和二價陽離子。Zakaria等[34]在250 μm石英毛細管柱內制備了有機聚合整體柱，單體為BMA、EDMA和2丙烯酰胺2甲基1丙磺酸混合物，之后表面涂敷季銨功能化乳膠顆粒，30 s即可分離無機離子和有機酸，30 cm長的柱，柱效為18,000 N/m。

　　3 毛細管離子色譜系統

　　毛細管離子色譜中影響柱效的一個重要因素是柱外效應。柱外效應是指由色譜柱填充床層或分離介質以外的因素引起的色譜峰形展寬而影響柱效的效應,主要是由進樣器、檢測器以及連接管路體積所引起的。由于毛細管離子色譜對柱外效應有十分嚴格的要求，常規離子色譜系統的各儀器部件都要做出相應的改造或重新設計才能使系統穩定、高效地運行。必須解決的幾個技術難題是：極低流速、準確的梯度控制;準確的小體積進樣;高信噪比、高靈敏檢測技術。

　　3.1 毛細管離子色譜系統的泵

　　高壓輸液系統性能直接影響整個儀器的重復精度、穩定性和分析定量準確度。目前多采用螺旋注射泵及往復柱塞泵作為輸液源。當流量在50~150 μL/min時，柱塞泵與注射泵均有商品儀可用于二元、三元及四元梯度淋洗模式。柱徑在50~300 μm毛細管柱，流量范圍通常在50 nL/min~4 μL/min。因為梯度淋洗要求泵系統有至少1%工作流量的控制精度和重復性，可以采用分流技術，使泵工作在最低穩定流量。LCPacking /Dionex的UltiMateTM微量泵即采用分流設計，低壓四元梯度淋洗，可在60 s內完成0~100%的梯度變化，流量范圍50 nL/min~200 μL/min。

　　3.2 毛細管離子色譜系統的進樣

　　對進樣裝置要求密封性好，死體積小。使用液相色譜系統進行樣品分析時，被分析物由進樣閥送至分析柱頭。樣品在閥內的擴散將會引起峰展寬，這使得進樣閥內定量管的體積不能太大。對于進樣量大于20 nL的樣品，可通過使用不同體積定量管的進樣閥;進樣量在20 nL以下的樣品，通常采用在進樣器與色譜柱之間裝一個分流三通的方法得到。還可以采用控制進樣時間或進樣體積，僅使一部分樣品到達柱頭的方法完成小體積樣品的進樣。毛細管離子色譜由于進樣量小而使得檢測靈敏度低，采用柱上濃縮和大體積進樣的方法有助于解決這一問題。

　　3.3 毛細管離子色譜系統的抑制器

　　若采用柱抑制器，會造成很大的死體積。膜抑制器可以大大減小死體積，在毛細管離子色譜中是一個很好的選擇。 Rokushika等[35]采用75~80 μm內徑的非常短的熱縮膜作為抑制器。Kuban等[36,37]在芯片上制作了更小的膜抑制器。

　　3.4 毛細管離子色譜系統的檢測器

　　3.4.1 電導檢測器 電導檢測器在離子色譜中應用最為普遍，對于安培檢測電活性不高和光學吸收比較弱的小無機陰、陽離子的檢測非常有效。電導檢測器可以分為接觸式和非接觸式兩種。常規離子色譜采用的電導檢測器通常為接觸式的。毛細管電泳所用的接觸電導檢測器池體積很小，適用于毛細管離子色譜。使用一對Pt微電極直接插入到激光打孔的毛細管內或置于分離毛細管末端，或在毛細管末端沉積一層金屬薄膜作為檢測電極。在電極上施加一定頻率的交流信號，當分離的樣品經過檢測電極時，由于樣品和緩沖溶液間電導的差別，產生響應信號。Dasgupta等[38,39]在電極設計中采用小內徑的金屬毛細管或針減小電導檢測器的體積以滿足毛細管柱對檢測器死體積的要求。他們報道的抑制電導檢測器將兩個100 μm直徑的鉑絲平行通過190 μm內徑的聚氯乙烯毛細管壁，彼此盡可能靠近[40]。Dionex公司使用盤狀金屬電極，上面的75 μm的孔作為檢測池[41]。

　　傳統接觸式電導檢測器由于在電極上易發生電化學反應，以及復雜基體樣品的吸附作用，致使電極污染而導致電極的響應性能變壞。因此，檢測電極必須經常作活化處理，必要時還需將電極拆下來清洗，由于使用的是微電極，操作困難，使用不方便，這是這種電導檢測器很難商品化的主要原因之一。Pungor等[42]設計了基于示波測量法的非接觸電導檢測器，檢測池連接到振蕩滴定儀上，包括兩個表面涂有甲基硅酮或聚四氟乙烯的同心電極。此后，他們又將此檢測器用于離子色譜柱后檢測器[43]，用高頻晶體振蕩器進行激發，評價了檢測器在抑制和非抑制離子色譜系統中的使用情況，結果表明與商品接觸式電導檢測器性能相當。Zemann 等[44]和da Silva等[45]分別研制了電容耦合非接觸電導檢測器(C4D)用于毛細管電泳。這種非接觸電導檢測使用的管狀電極僅簡單地套在分離毛細管外面，和管內的溶液不接觸，將一高頻交流信號作用在檢測電極上，電極和管內溶液電耦合形成一閉合回路，當樣品區帶經過檢測電極時，由于樣品和緩沖溶液間電導的差別產生響應信號。非接觸電導檢測避免了傳統電導檢測器中電極易于污染的缺點，加之這種電導檢測器使用的電極非常簡單，分離毛細管只需穿過檢測電極即可，使用起來非常方便。目前，非接觸電導檢測器在毛細管電泳[46]、毛細管電色譜[47]和微流控芯片中都得到了應用。譚峰等[48]制作的非接觸電導檢測器用于毛細管電泳檢測，對堿金屬、堿土金屬的濃度檢出限為5~16 μmol/L，響應線性范圍為10-6~10-3 mol/L。Kuban等[49]報道了非接觸電導檢測器在常規離子色譜中的應用，與接觸電導檢測結果一致。

　　3.4.2 光學檢測器 使用紫外和熒光檢測器時，毛細管柱多采用柱上檢測方式，即除去柱尾引出空毛細管外的聚酰亞胺涂層，將透明石英部分作為檢測窗口。由于吸收光程太短，采用紫外光柱上檢測最大的不足是濃度靈敏度低。增加光程可使靈敏度提高，常用的檢測池改造方式有鼓泡法和Z型池。鼓泡法通常只能提高靈敏度3~5倍，效果并不顯著，并且由于這種檢測池與毛細管柱的出口連接處在換柱時容易出現石英破裂，制作困難，且價格昂貴，實際中應用不多。Z型檢測池可較大程度地提高靈敏度，但是檢測池長度的增加也降低了分離效率，在Z形池的設計中靈敏度提高5倍的同時，分離度與分離效率約降低15%。目前，LCPacking/Dionex 可以提供體積為3 nL的Z型池紫外檢測器，Waters公司可提供池體積為250 nL的光電二極管矩陣檢測器。

　　熒光檢測器是一種高靈敏的、有選擇性的檢測器。毛細管離子色譜柱常常使用柱上檢測，樣品的熒光激發區和吸收光程都比常規檢測池要小許多，所以在毛細管離子色譜系統中使用熒光檢測器后靈敏度的提高不如常規離子色譜顯著。提高激發光能，發射光強度相應提高，這在一定程度上可增強靈敏度;但是與之相關的噪音如離散光、拉曼散射等也增強了。商品化的HPLC熒光檢測器很難適用于毛細管離子色譜。由于激光是高度平行光和高度相干光，具有單色性好、發散角小、強度高和準直性能好的特點，可以校準聚焦成比目前所使用的所有毛細管都細的微束(可被聚焦成幾μm的光斑)使能量高度集中射入毛細管內部，激發出強的熒光，并且能減小因毛細管壁的散射所引起的背景噪音，從而可以顯著地提高分析靈敏度。因此，激光是熒光檢測器的理想光源，特別適合于微型檢測池。激光誘導熒光檢測器是最靈敏的檢測技術之一，其靈敏度比通常使用的紫外可見吸收檢測高出2~3個數量級，濃度檢出限通常為 nmol/L~pmol/L，甚至可達10-9~10-13 mol/L。目前，激光誘導熒光檢測器的發展在毛細管電泳和微柱液相色譜方面得到了廣泛的應用。楊丙成等[50]對激光誘導熒光檢測器在微分離中的應用進行了綜述。

　　3.5 毛細管離子色譜儀的研制

　　Dasgupta等[51]報道了一套毛細管離子色譜系統，采用毛細管離子色譜柱為180 μm i.d.×56 cm，填充Dionex AS11陰離子交換填料，純水通過電滲析流動相發生器產生NaOH，抑制器80~100 μm內徑，長11 mm，配有毛細管池的電導檢測器。流速2 μL/min(線速度13 mm/s)時，柱壓<56 MPa。用毛細管填充柱和抑制電導檢測體系分離無機和有機陰離子。他們還研制了一種野外便攜式離子色譜儀，儀器外觀28 cm×43 cm×15 cm，質量10 kg[52]。在電滲析流動相發生器之前使用一個捕集柱去除雜質。采用180 μm i.d.×50 cm填充毛細管柱，帶有抑制電導檢測系統，檢出限可達μg/L級。Boring等[53]采用預濃縮柱與上述毛細管離子色譜柱聯用，檢測了μg/m3級的可離子化氣體。

　　4 展望

　　目前，有關毛細管離子色譜的研究在離子色譜領域得到了高度的重視。毛細管離子色譜可以大大節省流動相的消耗，對于動態改性固定相的研究，可以降低研究費用。整體柱在快速分離方面具有很明顯的優勢。有機聚合整體柱的制備過程又非常簡單，制備高效、快速分離的毛細管離子色譜整體柱是目前以及今后一段時間內研究的重點。目前，本實驗室研制了內徑為032 mm的強陽離子交換毛細管整體柱，成功地用于飲用水中Ca和Mg的測定;還制備了高離子交換容量的毛細管離子交換整體柱，柱長僅為15 cm，在60 mm/s的高流速下，5 min內分離了4種蛋白質。在毛細管離子色譜檢測器的研究中，非接觸電導檢測器具有池體積小，電極不受污染，使用壽命高等優點，具有很好的發展前景。

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