肝組織透射電鏡觀察

　　肝為五臟之一，主疏泄、藏血，在人體生理和病理活動中起著重要的作用，因而倍受重視。肝病，包括各類肝炎、肝硬化、肝癌等是我國的多發病。因此，掌握肝組織的電鏡研究方法對中醫實驗研究很有必要。

　　一、原理

　　人或動物的肝組織屬柔軟含水物體，在一般的電鏡下，不能直接觀察;也不能作超薄切片。超薄切片技術就是通過固定、脫水、浸透、包埋使之成為堅硬的固體而能在超薄切片機上進行超薄切片。而且在整個制樣過程中，又不能使肝組織細胞原來的結構遭受破壞。

　　另外，肝組織和其他生物組織一樣，主要是由較輕的低原子序數的原子如碳、氫、氧、氮等元素所組成，肝組織樣品中的這些原子，其電子散射能力很小。而且樣品被切成菲薄的切片(一般為50～70nm)，電子散射能力更弱，反差很低，無法攝得對比度清楚的電鏡照片。在樣品制備過程中用重金屬進行染色，就是要提高樣品的散射能力。

　　二、實驗準備

　　1.器材

　　存放電鏡標本的小瓶子(一般用青霉素瓶)

　　眼科手術剪刀、鑷子

　　剃須刀片

　　玻璃吸管

　　玻璃量筒、玻璃燒杯

　　塑料小砧板

　　牙簽

　　大小廣口玻璃瓶(存放鋨酸固定液的必須是棕色瓶)

　　天平、稱量紙

　　pH酸度計

　　存放洗滌液、緩沖液、脫水劑所需的潔凈玻璃瓶(容量500ml以上)

　　磁力棒、磁力攪拌機

　　微量OT針筒

　　搪瓷浸透盤

　　定向包埋模板

　　膠囊及膠囊架

　　電熱吹風機

　　隔水恒溫烤箱(37℃及60℃兩種)

　　吸水紙

　　超薄切片機及其附屬設備

　　超聲波清洗設備

　　修塊機和制刀機

　　特制玻璃條(制玻璃刀用)

　　玻璃刀或鉆石刀

　　金屬載網

　　專用鑷子

　　濾紙

　　培養皿

　　雙筒顯微鏡

　　載玻片

　　棕色廣口玻璃瓶(容量500ml以上，存放鈾染液用)

　　50ml的專用容量瓶(存放鉛染液用)

　　牙科用紅臘片

　　塑料小盒

　　透射電鏡及其附屬設備

　　2.試劑

　　2%戊二醛(Glutaraldehyde，C5H8O2)固定液(作前固定用)

　　0.1mol/L二甲砷酸鈉緩沖液(pH7.4)92ml

　　25%戊二醛原液8ml

　　存放于4℃冰箱保存。

　　2%鋨酸(Osmium Tetroxide，OsO4)水溶液(母液)

　　鋨酸1g

　　雙蒸水50ml

　　配制于棕色磨口玻璃瓶內。存放于4℃冰箱保存。

　　1%的鋨酸固定液(作后固定用)

　　0.1mol/L二甲砷酸鈉緩沖液1份

　　2%的鋨酸水溶液母液1份

　　存放于4℃冰箱保存。

　　0.2mol/L二甲砷酸鈉緩沖液(母液)：

　　二甲砷酸鈉42.8g

　　氯化鈣1.0g

　　雙蒸水加至1000ml

　　0.1mol/L二甲砷酸鈉緩沖液

　　0.2mol/L二甲砷酸鈉緩沖液(母液)250ml

　　雙蒸水250ml

　　最后用1 N HC1 將pH調至7.4，存放于4℃冰箱內保存。

　　洗滌液(0.1mol/L二甲砷酸鈉緩沖液)

　　脫水劑： 30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇

　　環氧丙烷

　　70%的乙醇醋酸鈾飽和液

　　包埋劑

　　618環氧樹脂(國產)4.5 g

　　十二碳烯基丁二酸酐(DDSA)3.5g

　　鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)0.35 g

　　2,4,6-三(二甲氨基甲基)苯酚(DMP-30)0.075 ml

　　(在上三藥品充分拌勻后，緩慢點滴加入)。

　　0.5%聚乙烯醇縮甲醛(Formvar )液(氯仿配制)

　　鈾染色液： 70%乙醇醋酸鈾飽和液(醋酸鈾或醋酸雙氧鈾一定量溶于70%乙醇中，以出現不能溶解，發生沉淀為度)。

　　鉛染色液：檸檬酸鉛(或叫枸椽酸鉛)染色液

　　硝酸鉛[Pb(NO3)2]1.33g

　　檸檬酸鈉[Na3(C6H5O7)·2H2O]1.76g

　　雙蒸水30ml

　　將以上懸液盛于有刻度的50ml容量瓶中，激烈地不斷地搖動30分鐘后，加入8ml新鮮配制的1N的NaOH，此時乳白色的混濁液立即變為無色透明溶液，再用雙蒸水加至50ml后備用。該染色液的pH為12，可保存數月。

　　3.實驗材料

　　大鼠肝

　　碎冰

　　三、實驗步驟

　　1. 取材

　　斷頭處死大鼠，迅速取出肝臟，用鋒利剃須雙面刀片切成大小為1mm3的肝組織，快速將組織浸入固定液，最好不要超過3分鐘。

　　2.固定

　　(1)將肝組織塊投入2%戊二醛固定液中，在4℃下作前固定1～2小時，固定液用量不宜少于組織塊體積的40倍。

　　(2)在4℃下用二甲砷酸鈉緩沖液或洗滌液洗滌漂洗2小時(4℃)或更長時間，中間換液數次(至少三次)。

　　(3)然后在4℃下用1%鋨酸固定1.5～2小時。

　　3.脫水

　　將組織依次放入30%、50%乙醇、70%的乙醇醋酸鈾飽和液(以上均為0℃～4℃)各約10分鐘(最后一步，可置于冰箱過夜);再依次放入80%、90%、100%、100%乙醇(室溫)各約10分鐘。

　　4.浸透

　　組織塊移入環氧丙烷20分鐘;再用環氧丙烷和包埋液按1：1混合浸透1～2小時(37℃)，再進入純包埋液中浸透2小時，室溫浸透(中間換一次包埋液)。

　　5. 包埋

　　(1)用牙簽棒將組織塊從上述浸透液中轉移到膠囊底部或包埋膜板槽的頂部，然后用包埋液把膠囊或模板槽灌滿。把寫好標本編號紙卷成環狀放在膠囊的上部，或放在模板槽內。

　　(2)將裝有組織塊的膠囊或模板放在37℃溫箱中浸透4小時或過夜。

　　(3)然后再轉入到60℃溫箱，放置48小時，使其聚合。硬化后從溫箱中取出，讓其自然冷卻。

　　6. 超薄切片

　　(1)包埋塊的修整

　　組織塊的修切對于超薄切片有很大影響，原則上組織塊修得越小，切片越能夠切得薄。

　　在許多情況下，常需要先切一些面積較大的厚切片(半薄切片)在光學顯微鏡下檢查，然后考慮選取某些細胞或組織塊某一部分作超薄切片。這樣可以將組織塊修切到0.5mm2或者稍大的面積。目前多半采用徒手修塊法。把組織包埋塊園端朝上裝進樣品夾上，放在雙筒解剖鏡下，調好燈光，一手緊持樣品夾，一手拿新的刀片，先在包埋塊的頂端平切一刀，露出組織，然后再在組織的四周以和水平面成45°的角度切四刀。這時組織面可稍為大些，以便切取半薄切片(0.5～2.0μ)，在相差顯微鏡下檢查或染色觀察之后，進一步定位進行超薄切片，定位后再修切至所需的盡可能小的組織切面。

　　組織塊的形狀可以直接修成正方形、長方形或梯形。

　　手工修塊雖簡便迅速，但準確性較差，表面也不夠光滑平坦。近年來已有商品修塊機出售，它們可保證錐體四面彼此精確地互相垂直，有助于切出高質量的超薄切片。

　　(2)金屬載網的準備及支持膜的制作

　　常用的載網有銅網、不銹鋼網、還有用鎳、鉑、尼龍等組成的載網。一般常用銅網，其它的常在某些電鏡的組織化學實驗中使用。

　　支持膜用Formvar(學名為聚乙烯醇縮甲醛)制作。先用氯仿配制成濃度為0.5%的制膜液，用干凈的載玻片浸入該液中靜置片刻，取出后垂直放在一濾紙上使多余的溶液流干。用鋒利刀片或小針頭沿膜的四周劃一刻痕，小心將膜漂浮于水面上，再把載網排列膜上，用濾紙輕輕撈起晾干備用。制膜時室內相對濕度要求在60%以下，如濕度太大，容易在膜上出現微孔。Formvar具有較好的機械強度和透明度，但formvar膜在電子束轟擊下易發生變形或小部分發生分解，為此，在高分辨工作中，經常要再噴涂上一層碳膜加固。

　　(3)制玻璃刀

　　當前用于超薄切片的刀有鉆石刀和玻璃刀。前者堅硬耐用，但價格昂貴。后者價格便宜，易于制作，可以制出很銳利的刀刃，因此受到最普遍的使用。

　　玻璃刀的制作有手工和機制兩種方法。手工制刀時，首先選擇厚約5～6mm、內應力小、從斷面觀察呈淡黃色、白色或略帶綠色的硬質玻璃，用鉆石玻璃刀把洗凈過的玻璃制成2.5×2.5cm或3.0×3.0cm的正方形小塊;然后從近乎對角的部位(距邊緣約0.5mm)劃一條約45°角的直線，再用平口鉗平行地夾住對角線的兩邊，向相反的方向拉成兩塊刀，其中成45°銳利的一塊便是所需的玻璃刀。在雙筒解剖鏡或低倍顯微鏡下檢查，刀刃平整光滑，無鋸齒狀波紋者為適用。

　　(4)刀槽及液面的調節

　　超薄切片只有漂浮在水面上或其他合適的液面上才便于收集、伸展和撈取，為此在刀口背部裝上一個小的水容器，通常稱為“刀槽”。通常用定制的硬塑料刀槽架或用一小段醫用橡皮膠纏繞過刀背，緊緊地粘在玻璃上，橡皮膠的后下部分用融化的牙科用紅臘密封，以防漏水。注意橡皮膠的頂端不應高出刀刃。

　　切片前在刀槽內加入雙蒸水，使切后的切片漂浮于液面上。液面的調節一般先加稍過量的液體使之凸起，以保證浸濕刀刃。然后在雙筒解剖鏡下用注射器或移液管慢慢吸去一部分液體，調整照明系統，當液面變成凹面、可見一反射光線的弧面，即為正確的液面。從這一光亮的反射光可看到切出的片子。在切片過程中由于液體蒸發，需加液以保證正確的液面。

　　(5)超薄切片

　　切片時將夾著修好組織塊的樣品夾安裝在切片機的樣品臂上，刀臺上裝好玻璃刀，其高度要與刀臺上的標準規等高，后斜角一般在3～5°，在顯微鏡下使樣品塊面的上下兩條平行邊與刀刃平行，如是梯形的應長邊在下面。調整好刀刃和組織塊的距離，再在刀槽內注入適量的雙蒸餾水。將切速放在2～5mm/秒，調節控制切片厚度的電流表，即可切片。當切片停止時，立即打開電吹風，冷卻樣品臂。撈片后關掉電吹風又可重新切片，或更換新刀。

　　切片厚度的判斷。一般是利用反射光干涉色來判斷切片的厚度，即從切片表面反射的光和從切片下面的水面的反射光發生干涉現象(見下表)。當用白光時，從雙筒顯微鏡下觀察兩種光線間的差別。

　　目前公認的樹脂包埋切片厚度與干涉色的近似值

干涉色	切片厚度
暗灰色	40nm以下
灰色	40～50nm
銀白色	50～70nm
金黃色	70～90nm
紫色	90nm以上

　　紫色切片太厚，電子束不易穿過，故不適用于電鏡觀察用。金黃色切片其分辨率也比較低。目前一般認為銀白色的切片是較理想的厚度，其分辨率可達2.5nm左右。也有人喜歡采用金黃色切片，尤其在細胞化學、放射自顯影中較適宜。

　　切片的展平和撈取。在切削過程中，由于切片很薄，經擠壓使切片發皺，甚至引起標本結構變形。為此，常用沾有氯仿或二甲苯的濾紙小片移近刀槽液面，試劑揮發性蒸汽可使切片軟化伸展。蒸發時間2～3秒鐘即可，不能把試劑滴入水槽。

　　撈片時，可用眼睫毛做成的小針把切片輕輕地撥離刀刃，并按需要把切片帶分成幾段。再用彎頭的小鑷子夾住銅網的邊緣，有支持膜的一面向下，與切片輕輕接觸，使切片貼附在銅網的膜上，輕輕提起并把膜面朝上，放于培養皿中無毛的濾紙上，待干經染色后即可電鏡觀察。

　　7.電子染色

　　預先取一個清潔的培養皿或塑料小盒，內放干凈的牙科用的石臘片(先切好長條形)。染色時，加1至數滴鉛染色液于臘片上，用鑷子夾住載網的邊緣，把貼有切片的一面朝下，使載網浮在液滴上，或者傾斜地輕輕插入染液中，蓋上培養皿和塑料蓋。在室溫條件下，染色數分鐘～10分鐘左右。載網從染液中取出后，必須盡快進行仔細清洗，以防染液蒸發沉淀，同時要避免呼吸直接對準載網，因人呼吸中含有大量的CO2，極易與鉛發生化學反應而產生鉛顆粒沉淀，污染切片。在放有雙蒸餾水的數個小燒杯中，漂洗數次，常用鑷子夾著載網清洗，除去載網上殘留液然后用小濾紙條充分吸干。用鑷子夾著載網清洗時，含在二尖之間的液體，可能會污染別的溶液或超薄切片，必須十分注意。因此在清洗完畢吸干時，用小濾紙條伸入二尖間隙內把液體吸干。

　　8.電鏡觀察

　　四、實驗結果

　　肝細胞為組成肝臟的主質細胞，其數量和體積約占肝實質的80%。肝細胞為多邊形，是高分化的細胞，有各種發達的細胞器，常作為細胞學研究的模式。肝細胞直徑一般為20~30μ，常隨生理、病理狀態而改變其大小。位于肝小葉不同部位的肝細胞，其大小也有差別。每個肝細胞有三個面，竇周間隙面、肝細胞面和毛細膽管面。電鏡下，正常肝細胞的超微結構幾乎具備各種細胞必須具備的的特點，即主要由細胞質膜、細胞質(含各種各樣的細胞器)及細胞核等構成。

　　細胞質膜又稱生物膜，它包括兩部分內容，一是指細胞與外環境之間的界膜，它構成細胞與外環境間的重要屏障;二是指細胞內各種細胞器間(包括細胞核)的界膜。電鏡下，細胞質膜經鋨酸染色后，呈內外兩層電子致密，中間夾有一層透亮層(常稱兩暗層夾一明層)。每層厚約3nm，三層總厚度為9～10nm。

　　細胞質中有各種各樣的細胞器。如核糖體，電鏡下為無包膜的電子致密的小顆粒，略呈圓形或橢圓形，平均直徑約15～25nm，通常散在分布于細胞質中或附著于內質網上。粗面內質網(簡稱RER)在電鏡下呈扁平膜囊狀、小管狀或囊泡狀結構，在其膜胞質溶膠面有核糖體附著，RER膜厚約6nm，RER膜所包圍的囊腔稱為RER池或RER腔。光面內質網(簡稱SER)在電鏡下呈小泡狀或短管狀;也有呈長管狀，但較少見;膜的厚度常小于6nm，表面無核糖體附著。高爾基體在超高壓電鏡下，低倍觀察厚切片，整個高爾基體表現為單個網絡結構，由波浪形帶狀或板狀結構相互連接成弓形、半球形或球形;高爾基體通常位于細胞中央部位并向四周或某一特定方向伸展，偶而可延伸到質膜下。線粒體在電鏡下為雙層單位膜包圍而成的封閉囊狀細胞器，其最外層膜為外膜;里面有內膜，內膜向內折疊形成許多嵴;內外膜之間的腔隙為外腔;內膜所包圍的腔隙為內腔。細胞質中還有如溶酶體、微體、中心體、微管和微絲等細胞器，以及胞質內涵物如脂滴等。

　　細胞核通常位于中央，呈圓形或卵圓形。核的最外層為核外膜、核內膜;內外膜之間的間隙為核周間隙;內外膜的融合處為核孔;細胞核中充滿著常染色質和異染色質，異染色質常呈團塊狀，染色較深，常染色質因染色淺淡而難分辨;中間有一個或多個核仁，其電子密度較高，外圍無膜包繞。代謝旺盛時，異染色質明顯減少;蛋白質合成功能活躍時，核仁可邊集。

　　五、注意事項

　　1.取材時注意事項

　　對任何組織或細胞來說，以下幾點要記住：

　　(1)快。所取材料盡量保持其生活時的狀態，這就要求從麻醉或處死的動物身上取材時操作必須快速力爭在處死動物后1分鐘內將組織浸入固定液。最慢也須在3分鐘內完成。在操作者的頭腦中要有這樣一個概念：瞬刻的時間差別就會引起超微結構的變化。

　　(2)小。組織塊不大于1mm3。這是由于電鏡中使用的固定劑穿透力較弱，如鋨酸中浸透組織1～1.5小時僅能穿透平均0.3mm，所以要求組織塊盡可能切成0.5mm薄。雖然醛類穿透力快一些但也不宜于超過1mm。否則，組織過大的話在外周的組織可以得到良好的固定，而在中央部位的組織由于固定劑不能透入而得不到及時固定，會發生細胞自溶現象。所以組織塊宜小容易固定。

　　(3)4℃低溫操作。動物組織的血液供給停止后，會發生自溶現象，這是因為組織和細胞內的各種酶，尤其是溶酶體里的各種水解酶釋放到組織內，使構成組織結構的主要成份如蛋白質、核酸等迅速降解。為了降低酶的活性，要求在0～4℃的低溫條件下操作，所用的容器和器械應預冷。

　　(4)避免損傷。在快速取材時，必須做到器械鋒利，用銳利的刀片垂直往下切，切時不要拉、鋸、壓。避免細胞受到損傷。

　　(5)器材保持干凈，不可有污染。

　　2.固定時的注意事項

　　(1)戊二醛固定一般為1～2小時，洗滌液多次浸洗時間原則上同固定時間，以免引起細胞雛縮現象。洗滌液盡量采用同系列緩沖液。

　　(2)鋨酸作為固定劑，其固定時間不宜超過2小時，如果固定時間過長，會引起一些脂蛋白復合體溶解，甚至會使組織發脆，造成組織切片困難。

　　3.電子染色時的注意事項

　　(1)鈾染色液作片染時，最好先將鈾染色液進行離心后取其上清液來作鈾染色。

　　(2)鉛的染色液很容易與空氣中CO2結合，形成碳酸鉛沉淀，造成標本的污染，所以在染色時，要盡量減少與空氣接觸，在操作時盡量避免和人呼出的CO2接近，要迅速蓋上蓋。有的人為了防止鉛沉淀污染，在培養皿內放置NaOH丸或0.1N的NaOH濕的濾紙，以吸收空氣中的CO2。

　　一般組織切片用鉛染色時間為數分鐘～10分鐘左右。需要注意是，過長的染色時間，不但不會增加反差，卻會出現脫色現象。電鏡染色很容易過頭，過染的結果使反差全部加強了反而使組織結構之間很少有區別了，這樣就失掉了染色的意義。