核酸分離純化實驗技術指南

上一篇 / 下一篇 2010-06-06 15:15:42

總RNA提取常見問題分析

      Q：RNA降解
      A：
      1. 新鮮細胞：如果試劑沒有問題，且外源性污染也可以排除，那么降解幾乎都來自裂解液的用量不足。如果將裂解液直接加入培養皿中裂解細胞，一定要使裂解液能覆蓋住細胞。
      2. 新鮮組織：某些富含內源核酸酶的樣品(如肝臟，胸腺等)，即使使用電動勻漿器勻漿也不能避免RNA的降解。更可靠的方法是：在液氮條件下將組織研碎，并且勻漿時使用更多裂解液。
      3. 冷凍樣品：樣品取材后應立即置于液氮中速凍，然后移至-70℃冰箱保存。樣品決不能未經液氮速凍而直接保存于-70℃冰箱中。冷凍樣品，即使是冷凍細胞，如果不在液氮條件下研磨碎，而直接加入裂解液中勻漿，RNA也比新鮮樣品更容易降解。樣品在與裂解液充分接觸前決不能出現融化，所以研磨用具必須預冷，在碾磨過程中要及時補充液氮。樣品研碎后，在液氮剛剛揮發完時，將樣品迅速轉移到含裂解液的容器中，立即混勻勻漿。
      4. 外源RNA酶的污染：試劑，器械及實驗環境中的RNA酶進入實驗系統。
      5. 內源RNA酶的污染：抑制劑失效或者用量不夠，實驗樣品過多；勻漿時溫度過高。

      Q：OD260/OD280比值偏低
      A：
      1. 蛋白質污染：確保不要吸入中間層及有機相。減少起始樣品量，確保裂解完全、徹底。加入氯仿后首先要充分混勻，并且離心分層的離心力和時間要足夠。如果所得 RNA的OD260/OD280比值偏低，則用氯仿重新抽提一次，再沉淀，溶解。
      2.苯酚殘留：確保不要吸入中間層及有機相。加入氯仿后首先要充分混勻，并且離心分層的離心力和時間要足夠。
      3.多糖或多酚的殘留：一些特殊的組織和植物中，多糖、多酚含量較多，這些殘留也會導致OD260/OD280比值偏低。因此，從這類材料中提取RNA 時，需要注意多糖、多酚雜質的去除。
      4.設備限制：測定OD260及OD280數值時，要使OD260讀數在0.1-0.5之間。此范圍線性最好。用水稀釋樣品：測OD值時，對照及樣品稀釋液請使用10mM Tris，pH7.5。用水作為稀釋液將導致比值偏低。

      Q：RNA提取得率低
      A：
      1. 該組織或者細胞中RNA含量偏低：不同細胞和組織中RNA的豐度不同，如肝臟，胰腺，心臟等是高豐度組織(總RNA含量2-4μg/mg)，腦，胚胎，腎臟，肺，胸腺，卵巢等是中豐度組織(總RNA含量0.05-2μg/mg)，膀胱，骨，脂肪等是低豐度組織(總RNA含量<0.05μg/mg)。
      2. 組織起始量太少或者太多：樣品量過少，則細胞組織中RNA含量較低；樣品量過多則可能超過裂解液的裂解能力，裂解將不完全，從而導致RNA得率低。

      質粒DNA提取常見問題分析
      Q: 未提出質粒或質粒得率較低，如何解決？
      A:
      1. 大腸桿菌老化：請涂布平板培養后，重新挑選新菌落進行液體培養。
      2. 質粒拷貝數低：由于使用低拷貝數載體引起的質粒DNA提取量低，可更換具有相同功能的高拷貝數載體。
      3. 菌體中無質粒：有些質粒本身不能在某些菌種中穩定存在，經多次轉接后有可能造成質粒丟失。例如，柯斯質粒在大腸桿菌中長期保存不穩定，因此不要頻繁轉接，每次接種時應接種單菌落。另外，檢查篩選用抗生素使用濃度是否正確。
      4. 堿裂解不充分：使用過多菌體培養液，會導致菌體裂解不充分，可減少菌體用量或
      增加溶液P1、P2和P3的用量。對低拷貝數質粒，提取時可加大菌體用量并加倍使用溶液P1、P2和P3，可以有助于增加質粒提取量和提高質粒質量。
      5. 溶液使用不當：溶液P2、P3在溫度較低時可能出現渾濁，應置于37℃保溫片刻直至溶解為清亮的溶液，才能使用。
      6. 吸附柱過載：不同產品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的質粒量很大，請分
      多次提取。若用富集培養基，例如TB或2×YT，菌液體積必須減少；若質粒是非
      常高的拷貝數或宿主菌具有很高的生長率，則需減少LB培養液體積。
      7. 質粒未全部溶解(尤其質粒較大時) ：洗脫溶解質粒時，可適當加溫或延長溶解時間。
      8. 乙醇殘留：漂洗液洗滌后應離心盡量去除殘留液體，再加入洗脫緩沖液。
      9. 洗脫液加入位置不正確：洗脫液應加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會完全覆蓋硅
      膠膜的表面達到最大洗脫效率。
      10. 洗脫液不合適：DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫，如洗脫緩沖液EB(10mM Tris-HCl, 1mM
      EDTA，pH8.5)或水。洗脫效率還取決于pH值，最大洗脫效率在pH7.0-8.5間。當用水洗脫時確保其pH值在此范圍內，如果pH過低可能導致洗脫量低。洗脫時將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加熱至60℃后使用，有利于提高洗脫效率。
      11. 洗脫體積太小：洗脫體積對回收率有一定影響。隨著洗脫體積的增大回收率增高，但產品濃度降低。為了得到較高的回收率可以增大洗脫體積。
      12. 洗脫時間過短：洗脫時間對回收率也會有一定影響。洗脫時放置1分鐘可達到較好的效果

      Q: 質粒純度不高，如何解決？
      A:
      1. 混有蛋白：不要使用過多菌體。經溶液P1、P2、P3處理，離心后溶液應為澄清的，如果還混有微小蛋白懸浮物可再次離心去除后再進行下一步驟。
      2. 混有RNA：RNaseA處理不徹底，請減少菌體用量或加入溶液P3之后室溫放置一段時間。如果溶液P1已保存6個月以上，請在溶液P1中添加 RNaseA。
      3. 混有基因組DNA：加入溶液P2和P3后應溫和混勻，如果劇烈振蕩，可能把基因組DNA剪切成碎片從而混雜在質粒中。如果加入溶液P2后過于粘稠，無法溫和混勻，請減少菌體用量。細菌培養時間過長會導致細胞和DNA的降解，培養時間不要超過16小時。
      4. P3溶液加入時間過長：P3溶液加入后，放置時間不要太長，否則有可能會產生小片段DNA污染。
      5. 含大量核酸酶的宿主菌：宿主菌含大量核酸酶，在質粒提取過程中降解質粒DNA，影響提取質粒DNA的完整性，最好選用不含核酸酶的大腸桿菌宿主菌，如 DH5α和Top10。
      6. 質粒的二聚體和多聚體形式：質粒復制過程中形成的，與宿主菌相關，電泳可檢測出多條條帶，單酶切處理后可變成單一條帶。

      DNA片段純化與回收常見問題分析
      Q：利用凝膠回收試劑盒DNA回收效率較低或者未回收到目的片段？
      A：可能有以下幾個原因：
         1. 膠塊未完全溶解，可適當延長水浴時間，并增加上下顛倒次數輔助溶解；
         2. 膠塊體積太大，應先將其切為小塊，分多次回收；
         3. 電泳緩沖液pH太高，硅基質膜在高鹽低pH結合DNA，如pH太高，應作適當調整；
        4. 漂洗液中未加入無水乙醇。

      Q：能否改用去離子水洗脫？
      A：可以。但是實驗室所用純水一般pH偏低，可利用NaOH適當調高其pH值，以增加洗脫得率。

      Q：回收DNA進行后續酶切實驗？
      A：洗脫產物含有殘留的乙醇會影響酶切，請確保徹底去除漂洗緩沖液，具體方法參見回收效率低的解決方案。

      Q：可否使用更小洗脫體積(小于說明書提供的最小洗脫體積)進行洗脫以提高濃度？
      A：不可以。因為說明書提供的最少洗脫體積是能完全覆蓋吸附膜的最小體積，若減少體積則不能將DNA完全洗脫下來。

      Q：電泳檢測只有一條目的帶，可否選用凝膠回收試劑盒？
      A：可以。如果后續實驗對片段純度要求較高，建議即使只有一條帶，也可以切膠純化，其回收得到片段的純度可能要比直接回收高一些。

      Q：瓊脂糖凝膠膠塊不溶？
      A：1. 瓊脂糖質量不好。2. 含目的片段的凝膠再空氣中放置過久，使膠塊失水、干燥，建議切膠后立即進行回收或將膠塊保存在4℃或-20℃。3. 制膠的電泳緩沖液濃度過高或陳舊。