實驗系統和實驗技術解釋

　　這篇博文專門解釋與實驗系統和實驗方法相關的技術細節問題, 尤其是為何作者Y FISH方法漏檢率高就一定是作者有意偽造由該方法所得的實驗數據?為何其Y FISH方法的高漏檢率的秘密對我老板團隊如此重要, 一旦暴光就會象多米諾骨牌較 應等等問題?這里有一個事實: 在成年干細胞可塑性研究領域中使用Y FISH方法和 熒光免疫多重標記來鑒定由供體干細胞在受體鼠體內變成的組織特化細胞的實驗 室并不多(其實是一個純技術的原因, 請見我以下的技術解釋), 我老板的實驗室是 這方面的大老級實驗室。

　　其實整個成年干細胞發育可塑性研究的大命題就是一個: 體內是否還存在此類干細 胞?如有此類干細胞, 則此類干細胞能否在體內分化成某些組織特化細胞, 如有的話, 這個生物學事件也是一個很低概率事件。所以此領域研究的核心就是如何用實 驗的方法來證明這個生物學過程: 成年干細胞在體內分化為某種組織 特化細胞。 我在博文-事件回放中所說, 老板團隊一直所用的實驗系統就是: 供, 受體鼠性別相 反的模型(sex mismatched model) 即以公鼠作為骨髓干細胞的來源, 受體鼠則為致死劑量照射的母鼠。即在宿主(母鼠) 組織中以Y染色體作為供體 (公鼠)干細胞來源的 識別標志。實驗方法或手段就是: Y FISH 以標記Y作為來源于供體干細胞的證據, 和熒光免疫標記組織細胞特化蛋白, 如胞漿中的角質蛋白-CK就代表上皮細胞, 包膜上的CD45代表白細胞。邏輯上和理論上這種實驗系統非常簡單明了, 是典型的 反推證明模式: 以Y/熒光免疫多重標記方式證明受體 (母鼠) 組織中“此陽性細胞-Y陽性和細胞標志蛋白陽性但CD45陰性”只能由供體 (公鼠) 細胞變成, 即中間過程無需也無法證明。但這就要求在技術上多重標記的每個標志的真實性得以確證-在陽性和陰性甚至空白對照上。理論上Y FISH外加熒光免疫的多重標記是最直接和確實的鑒定方法。但當時世界上大多數本領域有名的實驗室并不用此種Y /熒光免疫多重標記方法以鑒定受體鼠組織中來源于供體鼠干細胞變成的組織特化細胞, 而最多使用的是綠熒光蛋白(GFP)作為供體干細胞來源的標志。其實原因非常簡 單, 純技術上的原因。Y FISH其實就是DNA原位雜交, 而熒光 免疫標記就是抗原-抗體的反應, 這里是蛋白質-蛋白質的相互作用, 如CK和其相應抗體的結合- 這種結合力并不強 (與DNA分子雜交相比), 一旦遇上劇烈的實驗條件如 Y FISH 實驗中的 DNA變性條件(DNA denature, Y DNA is 97.5Mbp, it requires very harsh conditions to open its double strands, which is precondition for the Y probes to bind to its complementary sequences on the target- Y DNA) 既使已結合在目標蛋白上的抗體也會解離 (dissociate), 即達不到雙標記的目地。如果按傳統的Y FSIH方法 (用于石蠟 切片的方法-硫氰酸 鈉 80度處理, 再用鹽酸室溫下處理) 先作Y標記, Y FISH后則造成了組織和細胞結構 的很大破壞而使胞漿, 胞膜目標蛋白甚至不存在于片子上。即還是達不到雙標記目地。也就是這是兩類實驗條件不兼容的實驗方法, 即技術上的兩難 (dilemma)。 況且Y FISH的檢測敏感度也不見得很高, 一般而論, 在公小鼠 組織石蠟切片上傳統 的Y FISH方法標記后可達40%的細胞漏檢而被標記成Y陰性。 如用更溫和的條件下來作Y FISH以換取對組織和細胞結構的較輕破壞, 則Y FISH的檢測敏感度會進一步 降低。所以即使有人應用Y FISH方法在母鼠組織中鑒定出了 Y 陽性細胞, 也只說該細胞來源于公鼠的供體細胞。沒人會作如此反推理: 在公鼠樣本中或公鼠細胞中未檢測到Y就等于Y染色體丟式, 因為所有應用Y FISH方法的人均知道該方法有百分之幾十的漏檢率而將公鼠細胞標記成Y陰性 (除非他的Y FISH方法具有100% 的檢測敏感度或檢出率, 他才能作以上反推理。這在技術上是不可能的-技術瓶頸)。 所以老板的團隊在其文章FASEB 2007 中得有意偽造一組Y FISH陽性對照組的完美的實驗結果或數據以向審稿人證明作者在該文章中所用的邏輯推理前提是真實的: 即她們用于標記小鼠骨髓細胞片子 (bone marrow cytospins ) 的Y FISH方法 (protocol) 具有100%的檢測敏感度-也就是漏檢率為零, 所以在該文章中對于她們在實驗樣本中 (含公, 母鼠細胞-sex mismatched model) 的Y FISH結果作者可以做以上所講的反推理。該文章中作者所用的Y FISH陽性對照組就是正常的野生型公鼠骨髓細胞的Y FISH結果: 0.8 +/- 0.8 %的細胞缺乏Y染色體。這里作者還對這個假數據進行了偷梁 換柱的解讀 (這 0.8 +/- 0.8% 的正常公鼠骨髓細胞是缺乏Y染色體-即作者所言的 Y 染色體丟失而不是其Y FISH方法的漏檢) 以給審稿人送去信息: 即作者的Y FISH方法的檢出率本身仍為100%, 而那 0.8 +/- 0.8 % 的正常公鼠骨髓細胞是由于Y染色體丟失導致作者未能測到。這可是實驗方法學上一場徹頭徹尾的騙局, 因為作者完全知道她們用了多年的Y FISH方法(protocol) 在公鼠細胞片子 (肺細胞, 骨髓細胞)上具有很低的檢出率也就是很高的漏檢率, 即Y FSIH標記完后, 片子上仍會有很大比例的公鼠細胞因漏檢而被標記成Y 陰性。這就是為何作者從來不在其文章中顯示 Y FISH實驗陽性對照組全景圖像 (包含有幾十個公鼠 細胞在Y FISH以后的圖像) 的根本原因。

　　作者Y FISH方法的實驗原理如下:

　　這種方法的全稱是間期細胞Y FISH(間期細胞中所謂染色體是成染色質狀態-chromatin), Y探針是去與Y DNA上的互補序列雜交。探針的制備是以正常公鼠的Y DNA 為模板用 DOR-PCR先制備此探針的材料: 為500bp到幾個Kb大小的DNA片段 , 涵蓋幾乎整個Y DNA序列 (極高重復序列除外-有可能出現在其他染色體DNA序列中), 爾后用商品試劑合 Dig-Nick(其實就是 nick-translation) 反應將 Dig (digoxigenin) 標記到 DOR-PCR 所制備的 DNA 片段上, Dig 標記完后其產物就為100-500bp(Dig 標記的Y探針) 大小的混合物, 即Y探針混合物分段雜交到Y DNA 上的相應互補序列, 信號則來自于羅丹明標記的抗-Dig(Roche公司)。所以其實驗原理已決定: 任何一個公鼠細胞在Y FISH標記以后, 或為Y陰性 (漏檢, 因為無人的Y FISH 能達 100%的檢出率且相差甚遠)或含一個Y信號 (核中芝麻大小的粉紅點) 或含多個 Y 信號, 即根本就不存在胞核中一個Y信號就代表一條Y染色體的對應關系-這是其實驗原理已決定了!這也正是任何做Y FISH實驗的人會在熒光顯微鏡下看到的現象。 那怕就是用同樣的Y探針和同樣的抗-Dig, 不同的Y FISH方法 (protocol) 當然會在同樣的陽性對照樣本上 (正常公鼠組織細胞片或切片) 產生不同的檢出率。因為不同 的方法(protocol) 對實驗步驟規定了不同的實驗條件(溫度, 時間, pH 等等), 也就是說每一個不同的Y FISH方法 (protocol) 所具有的檢出率已被其本身所決定, 例如我的Y FISH方法的檢出率就遠高于作者的Y FISH方法(因為我的 protocol 所規定的實驗條件不同于作者的 protocol), 這就是科學技術。作者用于小鼠細胞片子 (cytospins) Y FISH 方法的硬傷是: 其 Y DNA 變性條件太差, 73度 5分鐘, 此條件不足以打開所有細胞核中的 Y DNA 雙鏈, 而這正是 Y 探針雜交的先決條件!而按照任何一個已建立的Y FISH方法 (protocol) 去做Y FISH實驗則很簡單, 即操作過程 并不復雜。

　　作者Y FISH方法(protocol)的高漏檢率與由這方法所得出的實驗結果的關系:

　　仍以作者文章 FASEB 2007 該方法的陽性對照組為例: 正常野生型公鼠骨髓細胞片子(bone marrow cytospins)Y FISH 結果; 平均值正負標準差或標準誤為: “0.8 +/- 0.8 % 的骨髓細胞缺乏 Y染色體”。這里只要知道兩個任何人也無法改變和否認的 事實, 則這組陽性對照組的Y FISH實驗數據的命運就已被決定了。1.作者Y FISH 方法本身所決定的高漏檢率, 而得到這個證據或事實的最確切和唯一的辦法就是實驗驗證其方法本身, 即嚴格按照作者的方法在正常公鼠骨髓細胞片子上作Y FISH 實驗, 標記完片子后, 在熒光顯微鏡下則真相一目了然: 所看到的只能是大百分幾十 的細胞因漏檢而被標記成Y陰性細胞-即所稱的假陰性, 因為在片子上每一個細胞均含有一條 Y 染色體, 而只是作者的 Y FISH 方法檢測不出而已。這正是由其方法 (protocol) 本身所具有的高漏檢率所決定的, 不管何人包括作者本人, 何時用這方法 (protocol) 在陽性對照上都會得到同樣的結果: 即大百分之幾十的公鼠骨髓細胞因漏檢而被標記成Y陰性細胞, 即作者的Y FISH方法只能產生高比例的假陰性而決非 小于1%的公鼠細胞為Y陰性。此仍實踐是檢驗真理的唯一標準, 而不是作者說或某 人說其Y FISH方法 (protocol) 能達100%的檢出率, 這方法就能真達 100% 檢出 率! 這 里所遵循的是實驗科學的一個基本原則：可重復性, 即任何實驗方法必須在同 樣的對照上產生同一趨式的結果。這里還有一個特點: 被檢測目標為 Y 染色體 DNA, 這是所有正常公鼠細胞中的常態恒定成分 (這也是遺傳學的基本原則, 所以 作者不能說其Y FISH方法在2007年以前能在公鼠細胞上測出100%檢出率, 現在不行了, 因被測目標- Y DNA 與以前不同了)。2. 獲得這種 Y FISH實驗結果數據的唯一方式(data acquisition)就是作者必須用自已的雙眼在熒光顯微鏡下去看由她們自已的 Y FISH方法所標記的正常公鼠骨髓細胞片子, 根據一個非常簡單和明顯的依據- 在被DAPI染成蘭色的胞核中有或無Y信號(粉紅色點)而對每一個細胞判別為 Y+ 或 Y- 并分類計數, 一個視野接著一個視野(一張骨髓細胞片子包含幾十個視野),而獲得那組陽性對照的Y FISH實驗數據(0.8 +/- 0.8 % 細胞缺乏Y染色體)作者必須看,判別,計數幾百個這樣的視野。整個過程無高科技,而只需要正確的科研精神-即誠實或事實求是: 將自已所看到的真實記錄下來以采集到真正的 Y FISH實驗結果的數據。作者Y FISH方法的高漏檢率就決定了在此Y FISH實驗結果的數據采集過程中,每個視野她們只能看到大百分之幾十的公鼠骨髓細胞因漏檢而被標記為Y陰性細胞而決非小于1%的細胞為Y陰性,而任何一雙誠實的眼睛是無法將每個視野下大百分之幾十的 Y 陰性細胞判別,計數成小于1%的Y陰性細胞的。證明完畢: 作者的這組Y FISH實驗數據只能是有意偽造的一組數字。因為文章需要此完美的數據, 否則無法通過審稿(文章中的邏輯推理前提),即作者以欺詐的方式而獲得這組完美的Y FISH實驗數據: 一則可能根本就沒做此實驗, 因為她們知道其Y FISH方法的高漏檢率是無法真正得到那種她們所需的完美數據的,有誰會有意去做無用功呢?其二作者有意將每個視野下所看到的大百分之幾十的Y陰性細胞寫成為小于1% 的Y陰性細胞。不管是那種情況,作者都是有意偽造實驗數據,在本案中連“誠實的錯誤”(honest error)也失較!

　　就象我再次舉報此案時反復對官方強調的那樣, 此案可算史無前例。這是由作者的造假方式所決定的, 作者膽大妄為, 其有意偽造的Y　FISH實驗數據不但遠遠 超出其方法的檢測敏感度, 而且遠超出該種實驗技術的技術瓶頸。這種實驗方法學上的 造假就決定了, 這種造假極易用邏輯上的反證法將其一步證死。作為舉報人我可以 用對照樣本證明在邏輯上和科學技術上用作者的實驗方法是不可能得出其文章中相應的實驗數據的并相差幾十倍: 這里是公鼠骨髓細胞Y　FISH方法的漏檢率只能是大百分之幾十, 但文章中作者白紙黑字寫下了 0.8 +/- 0.8 % 細胞缺乏Y染色體! 所以此案的關鍵點就只有一個且非常簡單: 到底作者Y　FISH方法的漏檢率是零還 是大百分之幾十? 此真相一出則此案大白。所以我于2009年2月再次舉報此案時, 只打擊一個實驗方法和一組陽性對照組的Y　FISH實驗結果數據“0.8 +/- 0.8 % 公 鼠骨髓細胞缺乏 Y染色體”。并將自已實驗驗證的片子本身 (物證), 所照的全景圖像, 技術解釋等等給了耶魯和ORI讓官方眼見為實。而官方對我提供的鐵證只能刻意回避, 因為對方無法面對這兩難處境。官方可以說我作為舉報人所提供的物證沒公信力 (credential)，但你可以對我所提供的最直接的物證進行交互驗證吧(cross-examination), 你耶魯, ORI,作者自己去驗證總可以吧。這正是我一直所要求的, 但 ORI告訴我: “他們看了也沒用, 因為他們沒裁決權!" 對方拿著我的物證是兩難: 如說他們已看了我所做的片子, 則必須承認大多數 (majority) 公鼠骨髓細胞漏檢而被 標記成Y陰性, 即假陰性, 這就必須承認作者有意偽造Y　FISH實驗數據。如對方想挑戰我的實驗驗證, 則他們須實驗證明作者的方法可以產生漏檢率為零或小于 1%的公鼠骨髓片子。我也明確無誤地告訴官方, 盡管我只打擊一個實驗方法和一組數據, 但只要其Y　FISH方法的高漏檢率暴光則為多米諾骨牌較應。

　　作者Y　FISH方法的高漏檢率和多米諾較應:

　　一旦其方法的高漏檢率暴光, 例如漏檢率為50%,只須用同理可得的道理則作者 FASEB 2007 文章中的下列結果的命運會如何: SPCKO公鼠組骨髓細胞片子Y　FISH的結果數據: 0.92 +/- 1.03 % 細胞缺乏Y染色體, 即Y陰性 p.2594;接受了野生型公鼠骨髓移植的SPCKO母鼠組骨髓細胞片子Y　FISH的結果數據: 94.18 +/- 2.48 % 細胞含有Y染色體, 即Y陽性; 接受了SPCKO公鼠骨髓移植的SPCKO母鼠組骨髓細胞片子的Y　FISH的結果數據: 93.28 +/- 1.78 % 細胞含有 Y染色體,即Y 陽性 p.2595; 圖4A,圖4B的結果和作者所用的邏輯推理前提; 再驗證作者用于石蠟切片的Y　FISH方法的漏檢率和Y/SPC雙標記方法, 則文中8只野生型公鼠肺切片的 Y/SPC雙標記的結果數據: 1000分之1000的雙陽性(請見第一作者2008年3月6日給我 的電子郵件: 她從來沒有將Y/SPC雙標記搞工作過, 她的實驗室看來連FISH也不工作了!) 和其他Y/SPC雙標記的實驗結果的命運會如何呢? 作者的其他Y/熒光免疫多重標記方法和其相應結果的命運會如何呢?目前我得先推倒第一張骨牌, 所以在 此對后續反應不作太多祥細分析。

　　老板團隊在期刊Science上反擊 Standford 團隊對其文章 Cell 2001的挑戰時所用的最大實驗依據就是其Y　FISH方法的超高檢測敏感度(請見我的博文-事件回放), 在接受了公鼠骨髓移植的母鼠的脾中她的團隊檢測到大于90%的脾細胞為Y陽性-所謂的 engraftment (意即她的Y　FISH方法的檢測敏感度本身仍為100%)。 這是一個雙重謊言, 其一她的Y　FISH方法的檢測敏感度離90%還差的遠, 漏檢率為大百分之幾十, 所以她無法在以上所說的脾中測出大于90%的脾細胞為Y陽性, 其二在這種小鼠模型中受體鼠的脾不可能發生大于90%的 engraftment (即大于90%的宿主脾細胞被來自于由供體干細胞變成的脾細胞所替代)。以下是我的實驗證據: 因我的專業是免疫學, 出于好奇心我想看看在這種致死照射后接受骨髓移植, 會有多少脾細胞 (T, B淋巴細 胞)被替代, 所以在我做的模型收獲時我也同時將脾收獲并用我自己的Y　FISH方法檢測脾。在接受母鼠骨髓移植的公鼠脾中Y陽性 (宿主) 與Y陰性脾細胞成分隔區域 分布, 并且Y陽性細胞并不少, 應該有大百分之幾十, 這與我在同一個體的骨髓細胞Y　FISH所看的 engraftment不一致, 骨髓片子上只有很小比例的細胞為Y陽性-即絕大部分骨髓細胞已被來自于供體干細胞生成的骨髓細胞所替代。而且所有的模型鼠均是這種現象, 即受體鼠脾細胞被替帶的比例并不是很大(我的Y　FISH方法也有一定的漏 檢率, 但我在受體鼠脾中仍能看到大比例的Y陽性細胞-宿主細胞)。仔細思考后我得出了自認為合理的解釋: 致死照射殺死了絕大部分的骨髓細胞, 但并沒有殺死大部分相對處于靜態的脾細胞, 所以宿主骨髓細胞必須大量快速被供體來源的骨髓細胞所替代, 而其脾中被替代區域應該為生發中心(germinal center) 那里有活躍的淋 巴細胞的死亡和增殖, 但脾中其他相對靜態的區域則沒理由被替代。

　　以上的例子也說明其Y　FISH方法的高漏檢率秘密對老板團隊的重要性。她在期刊細胞 (Cell 2001)上發表那篇大作后, 因無人能重復其結果, 所以該領域的主流實驗室均質疑其結果。Stanford團隊則是在期刊科學 (Science 2002) 上發表文章直接挑戰。 老板團隊反擊 (Science 2003) 的檔箭牌就是其Y　FISH方法的超高檢測敏感度, 即用你們的方法測不到, 但我的方法能測到。Stanford團隊在老板團隊的反擊后, 又在期刊科學 (Science 2003)上對老板的反擊進行了回擊, 但還是沒捉到要點, 因為外人并不知道其Y　FISH方法的高漏檢率。誰也沒有想到其實老板團隊一直在她的Y　FISH 方法學上唱的是空城計!我作為繼任她們研究項目的人當然會知此秘密, 2007年6月我用自己的Y/CK多重標記方法檢測正常公鼠肺細胞片子上(“Y丟失研究”)CK陽性和Y陽性，CK陽性但Y陰性的肺上皮細胞(參見我博文 -事件回放)。我有意讓老板看我的片子本身, 讓她明白在Y　FISH方法的漏檢率上與我玩把戲沒意思并且也沒用, 還是留著去騙外人吧 (我的方法檢出率本就高于她的方法) 別逼我會將Y　FISH 的漏檢而結論為Y丟失!她看了我的片子后又與 Erica 一起演雙簧給我看, 好象她們從未見過Y　FISH在公鼠細胞上的漏檢似的 (請見兩人2007年6月18, 19日的電子郵件 )。

　　成像系統和組織樣本細胞上的自發熒光:

　　在福爾馬林或PFA固定過的樣本上自發熒光非常普遍而且可以很強。不同的組織可以不同, 肺自發熒光很強, 同一組織中不同的細胞或同一種細胞的不同個體均可以表現不同。自發熒光可以是廣譜的, 從短光譜的蘭光到長光譜的紅光, 紅外光, 紅, 綠熒光極為常見而且可以很強(主要在細胞漿部分，胞膜上也可有)。老板實驗室的成像系統為: 熒光顯微鏡上配有多個濾光片。濾片1: 允許蘭光通過, 用于DAPI所染 的胞核, 濾片2: 允許綠光通過, 用于FITC標記, Alexafluor488等, 濾片3: 允許紅光通過, 用于羅丹明-Y的信號, 濾片4: 允許紅外光如Cy5通過-肉眼不可見, 濾片5: 允許紅, 綠熒光通過, 看片子時一般先用此濾片看紅, 綠熒光的標記。照像則為: 從濾片1開 始, 設定暴光時間后OK, 依次重復操作到濾片4, 最后OK后, 則一張彩色電子圖像形成, 和各個濾片下所攝的一張黑白圖像形成并自動貯存于所聯的機算機。也就是說在各個濾片下可以設定不同的暴光時間以改變不同顏色光在最后所形成的圖像中的強度。所以這種實驗手段和獲取圖像的方式為制作假電子圖像留下了巨大的空 間。例如在小鼠肺石蠟切片或細胞片(cytospins)一個具有紅, 綠自發熒光的細胞 (在 濾片5下, 肉眼可見為黃色), 只需調整濾片2和濾片3下的不同暴光比例 , 則這個細胞在最后形成的彩色圖像中即可以是紅色熒光標記, 也可以是綠色熒光標記。也就是說將胞漿中的自發熒光做假成特異性抗體標記的“信號”在這種電子圖像中并不難。辯別這種假圖像的最好方法就是與真正的陽性對照細胞圖像作比較并且用全景圖像-含有“內參照”系統。因為真正由抗體所產生的熒光信號來自于一種純的熒光分子所發射, 如Alexafluor488, 這種熒光的光譜很窄, 所以顏色看起來很純而與廣譜的自發綠熒光不同。請見我上傳的Y/熒光免疫多重標記的全景圖像和圖解, 尤其是英 文的圖解 (Fig.legend)。作假的圖像往往只能顯“點”而不能顯“面”, 即有意“裁 切掉”內參照系統-片子上其他細胞的信息。