關于雙向電泳

樣品制備（Sample Preparation）
1.1 一般性原則：
樣品制備是雙向電泳中最為關鍵的一步，這一步處理的好壞將直接影
響2-DE 結果。目前并沒有一個通用的制備方法，盡管處理方法是多種多
樣，但都遵循幾個基本的原則：1）盡可能的提高樣品蛋白的溶解度，抽
提最大量的總蛋白，減少蛋白質的損失；2）減少對蛋白質的人為修飾；3）
破壞蛋白質與其他生物大分子的相互作用，并使蛋白質處于完全變性狀
態。
根據這一原則，樣品制備需要四種主要的試劑：離液劑(chaotropes),
主要包括尿素（Urea）和硫脲（thiourea）；表面活性劑（sufactants），
也稱去垢劑，早期常使用NP-40、TritonX -100 等非離子去垢劑，近幾年
較多的改用如CHAPS 與Zwittergent 系列等雙性離子去垢劑；還原劑
（reducing agents ），最常用的是二硫蘇糖醇（DTT），也有用二硫赤蘚
糖醇（DTE）以及磷酸三丁酯（TBP） 等。當然，也可以選擇性的加入
Tris-base,蛋白酶抑制劑（ 如EDTA 、PMSF or Protease inhibitor
cocktails ）以及核酸酶。
樣品的來源不同，其裂解的緩沖液也各不相同。通過不同試劑的合理
組合，以達到對樣品蛋白的最大抽提。在對樣品蛋白質提取的過程中，必
須考慮到去除影響蛋白質可溶性和2DE 重復性的物質，比如核酸、脂、
多糖等大分子以及鹽類小分子。大分子的存在會阻塞凝膠孔徑，鹽濃度過
高會降低等電聚焦的電壓，甚至會損壞IPG 膠條；這樣都會造成2-DE 的
失敗。樣品制備的失敗很難通過后續工作的完善或改進獲得補償。
核酸的去除可采用超聲或核酸酶處理，超聲處理應控制好條件，并防
止產生泡沫；而加入的外源核酸酶則會出現在最終的2D 膠上。脂類和多
糖都可以通過超速離心除去。透析可以降低鹽濃度，但時間太長；也可以
采取凝膠過濾或沉淀/重懸法脫鹽，但會造成蛋白質的部分損失。
因此，處理方法必須根據不同的樣品、所處的狀態以及實驗目的和要
求來進行選擇。

1.2 樣品制備程序：
1.2.1 培養細胞（culture cell）樣品處理方法：
培養動物組織細胞由于沒有細胞壁，因此可以將細胞收集下來，直接
加入裂解緩沖液（Lysis buffer）抽提總蛋白。裂解緩沖液有多種配方，
本實驗室主要采用如下成份：
(A) 7M Urea，2M Thiourea，4％（w/v）CHAPS，40mM Tris-Base，
40mM DTT，2％ Pharmalyte pH 3-10.
其他常用的裂解緩沖液如下：
(B) 9.5M urea, 2%(w/v) CHAPS, 0.8%(w/v) Phamarlyte pH3 -10,
1%(w/v) DTT and 5mM Pefabloc proteinase inhibitor;
(C) 加入0.3 -1% SDS 在95 oC 煮樣品5mins ，冷卻后加入至少5
倍體積的（A）或（B）裂解液。
總蛋白抽提程序：
（1） 培養細胞的收集；
（2） 用磷酸緩沖液（PBS）洗細胞3 次（室溫，1000g， 各2min）；
（3） 將細胞分裝到1.5ml Eppendof 管中，吸干殘留的PBS；
（4） 加入裂解緩沖液（1.5x106 個細胞大約加入100μL 裂解液），在室
溫振蕩1h，使其充分溶解；
（5） 4oC，40,000g，離心1h；
（6） 吸取上清并用Brandford 法定量蛋白，然后分裝至Eppendof 管里
保存在-78oC 備用。
1.2.2 組織樣品處理方法：
對大多數從動物或植物組織里提取總蛋白質而言，同樣沒有一種通用
的程序。但遵循的原則基本相同。下面列出一種對植物樹葉總蛋白的方法。
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三氯醋酸－丙酮沉淀法（TCA/acetone precipitation）提取植物樹葉總
蛋白程序：
（1） 在液氮中研碎葉片；
（2） 懸浮于含10％三氯醋酸（TCA）和0.07%?-巰基乙醇(可用DTT
替代)的丙酮溶液在－20 oC 的冰浴；
（3） 讓蛋白質沉淀過夜然后離心（4oC，40,000g, 1h），棄上清；
（4） 重懸沉淀浮于含0.07%β -巰基乙醇的冰預冷丙酮溶液里；
（5） 離心（4oC，40,000g, 1h）后真空干燥沉淀；
（6） 用（A）或（B）裂解液溶解沉淀，離心（4oC，40,000g, 1h）。
（7） Brandford 法定量蛋白，然后分裝至Eppendof 管里保存在-78oC
備用。
超速離心法：
（1）取材；
（2）用研缽在液氮冷凍條件下將樣品研成粉末，每1g 樣品加入0.5ml 裂解液，
使用組織勻漿器勻漿30 s；
（3）組織懸液15℃，10 000×g 離心10 min；
（4）上清液4℃，150 000×g 超速離心45 min；
（5）小心避開上層漂浮的脂質層，吸取離心上清6℃ 40,000g 再次離心50 min；
（6）取離心上清。Bradford 法定量，分裝后置–75℃保存。