蛋白質組在醫學研究中的進展

上海長海醫院血液科 潘竹林 李津嬰 閔碧荷

　隨著分子生物學的飛速發展，最為世人矚目的人類基因組計劃即將提前完成。人類將向了解自己的生命奧秘這一目標邁進一大步。但是，由于基因是遺傳信息的攜帶者，而生命活動的執行者卻是蛋白質，即基因的表達產物。因此，即使得到人類全部基因序列，也只是解決了遺傳信息庫的問題。人類揭示整個生命活動的規律，就必須研究基因的物產——蛋白質。相對于基因組而言，后者稱為蛋白質組。

1 蛋白質組概述及其相關研究技術和方法

鑒于基因組研究的局限性，1994年澳大利亞Macquaie 大學的Wilkins和Williams等在意大利的一次科學會議上首次提出了蛋白質組（Proteome）這個概念。定義為“蛋白質組指的是一個基因組所表達的蛋白質”，即“PROTEOME”是由蛋白質的”PROTE”和基因組的“OME”字母拼接而成[1].這個新術語很快得到了國際生物學界的認可。目前對蛋白質組的分析工作大兩個方面。一方面，通過二維膠電泳等技術得到正常生理條件下的機體、組織或細胞的全部蛋白質的圖譜，相關數據將作為待測機體、組織或細胞的二維參考圖譜和數據庫。另一方面是比較分析在變化了生理條件下蛋白質組所發生的變化。目前蛋白質組研究技術常用以下手段：（1）用于蛋白質分離技術方面的如雙向凝膠電泳（2-DE）、雙向“高效”柱層析等。（2）用于蛋白質鑒定的技術如質譜技術、凝膠圖像分析、蛋白質和多肽的N端、C端測序及氨基酸組成分析等。（3）用于蛋白質相互作用及作用方式研究的雙雜交系統。（4）用于分析大量數據的生物工程信息學等[2].。

2 蛋白質組在醫學研究中的現狀和前景

自蛋白質組概念提出以來，已發表相關論文及論著數篇。并于是1997年舉行了第一屆國際性的“蛋白質組學”會議。同年出版式了第一部蛋白質組學的專著。目前蛋白質組在醫學方面的研究重點在于對人類疾病的發病機制、早期診斷及治療，對致病微生物的致病機理、耐藥性及發現新的抗生素為主。現將這兩方面的進展情況綜述如下。

2.1 人類疾病的蛋白質組研究

2.1.1 直腸癌

直腸癌的發生是因多個基因的突變，導致腫瘤抑制基因失能所致，但確切機制仍不清楚。為探討其發病機制，Sanchez等對15例結腸癌和13例正常人的結腸上皮進行2-DE，每個多肽模式用Melanie I12-DE分析軟件進行分析。據此建立了包括882和861個斑點的結腸癌及正常人結腸粘膜的標準膠圖。結果發現在分子量為13kD和pI值為5.6處的蛋白質僅出現在結腸癌的組織中。15例結腸癌患者中13/5.6蛋白有13例（87%）。此外，發現13/5.6蛋白不僅在中度、低度分化的結腸癌及有24年病史的潰瘍性結腸炎過度表達，而且出現在7例分化程度不同的腺瘤的癌前病灶。但對照組則極少出現。這表明該蛋白的出現對檢測早期直腸癌有很強提示。通過對該蛋白HPLC及測序等分析后，發現與鈣粒蛋白B（calgranulin B）及鈣衛蛋白（calprotectin）有很大關系[3]。

2.1.2 肝癌 醛糖還原酶（aldose reductase, E.C.1.1.1.21）

是醛酮還原酶超家族中的一個成員。它催化葡萄糖還原為山梨醇，通過減少內源或外源性代謝產物而起到解毒作用。Peter R等在用N-甲基-N-亞基脲誘導（N-methly-N-nitrosourea-induced）的小鼠肝癌中，用2-DE及氨基酸微型測序可分辯出一種肝癌誘導的醛糖還原酶樣的蛋白質（35Kd/P17.4）。而在小鼠的晶狀體中，則發現一種醛糖還原的同工酶，該酶與已知的小鼠醛糖還原酶有98%的同源性，而與肝癌誘導的醛糖還原酶樣的蛋白質截然不同。這表明兩種蛋白質是由相關的兩條基因編碼，在小鼠不同的器官中表達不同。肝癌誘導的醛糖還原酶蛋白質優先表達在肝癌及胎肝中，它們均受到纖維細胞生長因子的刺激，但隨小鼠鼠器官的生理及病理環境而表現不同的形式。經免疫組化證實，肝癌誘導的醛糖還原酶樣的蛋白質在成人肝臟中不表達，但在小鼠的肝癌 中又重新表達。同時發現該蛋白在癌前病變及肝癌中表達強烈，而在肝臟周圍的正常組織不表達[4]。表明該蛋白可能與肝癌的發病有很大關系。

2.1.3 擴張型心肌病

擴張型心肌病是一種嚴重的可導致心衰的心臟病，大多數患者需行心臟移植術。目前其發病機理不明，推測可能為多種因素所致。1990年已有兩組人員進行該病的蛋白質組分析。其后不久心肌的2-DE數據庫建成，并進入國際互聯網絡。Knecht等采用2-DE取得了3300個心肌蛋白條帶，通過氨基酸序列分析、Edman降解法及基質輔助的激光解吸離子化質譜（MALDI-MS）等分析了其中150條。經活檢及術后病理證實，有12條為擴張性心肌病特有的蛋白。但具體資料尚在進一步分析之中[5]。Arnott D等對新福林誘導的肥大心肌細胞進行蛋白質組分析，同對照相比亦發現有8種蛋白質的表達水平發現了變化[6]。

2.1.4 膀胱癌

IFN-γ除抗病毒外，還有一項重要的功能即抗腫瘤作用。目前其抗腫瘤作用機制不明。有資料表明，IFN-γ可能通過在相關細胞中增強或抑制有關基因而發揮抗腫瘤作用。重組IFN-γ和IL-2已開始應用于膀胱癌的治療中。為探明其作用機制，George等將四種分級程度不同的人膀胱癌新鮮活檢標本，用50U/ml IFN-γ作用20個小時后，采用2-DE、微型序列分析、等電聚集、蛋白質印跡等方法，對標本進行蛋白質組分析。結果表明有五種蛋白質（色按酸-tRNA合成酶、IFN-γ誘導的r3，超氧化物歧化酶及兩種分子量為35.8kD和11.2kD的未知蛋白）的表達量增加了75%，而醛糖還原酶表達量則下降。為研究IFN-γ對治療膀胱癌的作用機制提供了一種方法[7]。
此外，由于缺乏對膀胱鱗狀細胞癌客觀可靠的組織學分級標準，因而很其進行早期診斷。為此，Morten等對150例膀胱癌進行雙盲法2-DE，并結合了蛋白質印跡法、微型序列分析及質譜等技術，建立了新鮮膀胱癌標本的2-DE數據庫，且發現角蛋白10、14及銀屑病相關的脂肪酸結合蛋白（psoriasis-associated fatty acid-binding protein,PA-FABP）等可以作為膀胱癌不同分化程度的標記物[8]。為早期診斷提供了一種新的手段。

2.1.5 其它

目前人的各種組織、器官、細胞乃至各種細胞器已被廣泛研究。以期為疾病診治及了解發病機制提供新的手段。在一項利用蛋白質組研究技術進行的酒精對人體毒性的研究中發現，乙醇 會改變血清蛋白糖基化作用，導致許多糖蛋白的糖基缺乏，如轉鐵蛋白[9]。Jagathpala等對免疫所致的不孕癥的男性精子蛋白質進行蛋白質組分析，發現了導致不孕癥的6種自體及異體抗 精子抗體[10]。在對腎癌的研究中，發現有4種蛋白質存在于正常腎組織而在腎癌細胞中缺失。其中兩種分別是輔酶Q蛋白色素還原酶和線粒體乏醌氧化還原復合物I。這提示線粒體功能低下可能在腫瘤發生過程中起重要作用[11]。Ekkehard Brockstedt等利用2-DE、Edman微型序列法、MALDI-MS等對人BL60-2伯基特淋巴瘤細胞系進行了細胞凋亡機制的研究，結果發現RNA聚合酶轉錄因子3a（BTF3a）和/或BTF3b與抗IgM抗體介導（anti-IgM antibody-mediated）的細胞凋亡有很大關系[12]。

2.2 致病微生物的蛋白質組研究

近年來，WHO越來越重視感染性疾病對人類健康的影響。除結核、多重耐藥鏈球菌感染及機會致病菌外，出現了一些新的感染因素如HIV、博氏疏螺旋體及埃博拉病毒等。因此這些致病微生物的蛋白質組分析，對于了解其毒性因子、抗原及疫苗的制備非常重要，此外對疾病的診斷、治療和預防也同樣重要。現已獲得18種微生物的全部基因組序列，另有60余種的基因序列正在研究之中。這些工作的開展為蛋白質組的研究提供了有利條件。

2.2.1 檢測博氏疏螺旋體與免疫有關的蛋白質

博氏疏螺旋體（Borrelia burgdorferi）是萊姆病的主要病因，表現為環形紅斑及流感樣癥狀，大約有50%的未治患者發展為神經系統及關節系統疾病。該螺旋體可分為3種類型：B.burgdorferi sensu stricto,B.garinii, B.afzelii。其診斷需依靠血清學檢查，但存在敏感性及特異性變化的缺點。為獲得更可靠的血清學檢查，Peter等用2-DE從B.garinii得到217個銀染的蛋白斑點。從中國兔多克隆抗體鑒別出6個已知的譏原。將不同臨床表現萊姆病患者的血漿用b.garinii 2-DE圖雜交。用抗IgM及抗IgG作為第二抗體，在10例有游走性紅斑的患者血漿中，檢測出60~80個抗原。同時發現在有關節炎的患者血漿中，包含有抗15種抗原的IgM抗體及抗76種不同抗原的IgG抗體。而晚期有神經系統癥狀的患者血漿中，則包含有抗33種抗原的IgM抗體及抗76種抗原的IgG抗體。上述3種類型患者的血漿中均包含有抗6種已知抗原的抗體，且被SDSPAGE雜交所證實。這些抗原均是潛在的具有特異性診斷的標志物。

2.2.2 弓形體抗原的檢測

弓形體病是由鼠弓形體蟲引起的寄生蟲病。全球人口大約有30%是攜帶者，在歐洲是最常見的寄生蟲病。如果妊娠者感染，該蟲可通過胎盤引起胎兒的感染。且隨著妊娠時間的增加，感染的機會也增加。大約50%母體的感染可引起新生兒先天性疾病。因此診斷及治療越早越好。目前要依靠血清學及PCR，而單獨采用血清學如用IgG，IgM,或IgA抗體對疾病活動期敏感性不夠，尤其對于妊娠或有免疫抑制的患者。潛在感染常發生在有免疫抑制的患者中。對AIDS患者來說，鼠弓形體蟲是最主要的致命性腦損傷的病因。因此，能否早期診斷對治療來說尤為關鍵。Jungblut等將鼠弓形體蟲RH株在人羊膜細胞系FL521中傳代后，用2-DE得到300個銀染的斑點。再將其與以下3種患者的血漿進行免疫雜交：（1）患有急性弓形體病的妊娠女性（n=11）; (2)患急性弓形體病的非妊娠者（n=6）(3)有潛在感染的患者（n=9）。結果有9個斑點對各階段的弓形體感染均反應，這9種斑點被用來當作弓形體感染的標記。其中7種標記可用作區別疾病的不同階段。但對區別急性期與潛在期仍需聯合應用多種抗原[4]。

2.2.3 白色念珠菌

芽管結構是白色念珠菌向菌絲體轉變的早期階段，該結構能增強白色念珠菌對宿主細胞的粘附力、穿透力及破壞性。目前通過蛋白質組分析方法如2-DE、質譜等已檢測出在芽管結構所表達的一組特異蛋白如DNA結合蛋白等，為致病提高了一些參考指標[13]。Monkt等發現，在conA反應后的SDS-PAGE圖中，在芽管結構的膜上，分子量為80kD復合糖處，出現很淡的考馬斯亮藍染色，而在孢子時則未出現。提示膜的整合、出現未與ConA結合的80kD復合糖可能與芽管結構的發生及生長有關。粘附素（adhesin）是白色念珠菌表面的組成部分，介導其與宿主的結合，是侵入宿主所需的重要蛋白，包含多種成分如白色念珠菌胞壁上的疏水蛋白等，通過增強菌株的粘附性而在其致病機制中發揮一定作用。但由于這些蛋白有很大同源性、多種糖基化作用及與胞壁或胞漿膜上其它成分形成共價結合，故提純及分析很難。現通過等電聚集、2-DE及洗脫電泳等方法，可使這些蛋白得到很好的純化、分離及分析[14]。

抗真菌藥通過改變真菌胞壁組分的生物合成和重組胞壁相關酶的結合位置而發揮作用。抗真菌藥遠少于抗細菌藥就在于對真菌細胞壁蛋白分析了解太少。現在臨床上用于抗真菌的藥物多為咪唑類（咪康唑、酮康唑）及三唑類（氟康唑、伊曲康唑），但有很多患者出現耐藥現象。在白色念珠菌中，目前發現至少有8種CDR家族的基因可產生耐藥株的表現型。且有55種基因分別表達ABC及MFS蛋白（菌內藥物輸出泵）[15.16]。但這些基因、蛋白與耐藥之間的關系仍未清楚。應用2-DE、免疫檢測蛋白質等技術，對這些蛋白在菌內的表達量進行分析，發現Cdrlp及CaMdrlp蛋白在耐咪唑類菌株中過量表達。在對咪唑類每感及去除CDR1基因的白色念珠菌株CA114中，提取并檢測耐氟康唑突變子（FL3）的表達。結果發現FL3對氟康唑的耐是去除CDR1的基因的白色念珠菌株CA114的500倍 ，是CA114的250倍。且CDR1 mRNA在FL3的量是Ca114的8倍[17]。同時，對敏感性及耐藥株蛋白質的2-DE圖分析發現，在耐中有25種蛋白質增加，有76種蛋白質減少。推測白色念株菌是通過改變染色體數目或染色體重組來調節基因的表達量，進而產生耐藥性[18]。隨著蛋白質組技術成熟完善，將對真菌壁及耐藥基因分泌的各種蛋白組成分析帶來重大突破，并對抗真菌的研制提供重要資料。

雖然蛋白質組學還處在一個初期發展研段，但我們相信隨著其不斷地深入發展，蛋白質組（學）研究在提示諸如生長、發育和代謝調控等生命活動的規律上將會有所突破，對探討重大疾病的機理、疾病診斷、疾病防治和新藥開發將提供重要的理論基礎。

　摘自：《國外醫學臨床生物化學與檢驗學分冊》2002年第23卷第1期