液相色譜質譜聯用儀新型高通量前端系統

　　質譜( MS )技術應用于藥物發現已有數十年。從以往來看，儀器產生的數據大大超過軟件處理的能力。近年來，軟件的速度和分析能力大大提高，促使儀器制造商轉向提高系統的效率和通量。這大大提高了質譜前面分離技術的革新，比如從液相色譜發展到高壓液相色譜以及超高壓液相色譜。

　　最進前端技術的發展側重于提高質譜的效率，一般是提高進樣速度和質譜分析速度。如最近開發的多維液相色譜技術(LC)和激光二極管熱解析技術( LDTD )，二者都是通過增加質譜儀有效檢測數據的時間，并最大限度減少其空閑時間，從而達到提高效率的目的。

　　為實驗室選擇最佳的高通量技術需要認真考慮對通量的要求以及技術的特點。當評估多維液相色譜和激光二極管熱解析時，科學家至少應考慮三個主要問題：速度，靈敏度和系統易優化性。本文介紹了兩種技術的基本原則，并比較他們在兩個共同的藥物發現應用中的性能。

　　前端可替代技術

　　多維液相色譜

　　多維液相色譜系統是使用多于一個的高效液相色譜將樣品注射到單一的質譜儀，使其提高通量。每個通道可以獨立操作，用戶在所有四個通道可以同時運行相同的方法，或者每個通道都有不同的方法。雙通道系統的通量是單液相色譜通量的一倍，而一個四通道系統的通量是其四倍，將質譜的空閑時間從百分之七十五減至百分之四。多維液相色譜系統最大程度地利用質譜儀，使質譜幾乎沒有空閑時間。

　　多維液相色譜技術有很多優點。最重要的是沒有通過犧牲色譜分離而提高了樣品的通量。因為每一路的液相色譜的操作是分開和平行的，在整個洗脫步驟中，質譜是對單個樣品進行分析，在整個過程中保持數據質量和靈敏度。軟件可以控制泵的操作，閥切換，清洗和梯度程序。

　　此外，每組樣品的分析都是在單一液相色譜系統中運行。標準樣品，質控樣品和待研究樣品的分析都是在同一個硬件上完成。與一臺通過閥切換的液相色譜質譜沒本質區別。只要實驗設計合理，多維液相色譜系統的日內和日間精密度和準確度都可以滿足LC-MS/MS的公認標準。

　　激光二極管熱解析

　　激光二極管熱解析與液相色譜是根本不同的，因為它不需要液相。激光二極管熱解析是將2-10μL的樣品注入到96孔板中。每一個孔底部植入一塊金屬。將該盤室溫干燥。用激光二極管加熱孔，使干燥的樣品迅速產生熱解析。完整的熱解析分子被載氣帶入到大氣壓化學電離區域進行離子化。大氣壓化學電離不需要溶劑或流動相就可以完成，這改變了離子化的特征，可以分析那些在普通大氣壓化學電離不能有效離子化的化合物。

　　熱解吸能產生完整的解吸附分子，溫度低于熔點。激光二極管熱解析的性能源于高的加熱速率，載氣流量以及高靈敏度

　　激光二極管熱解析消除了樣品交叉污染的風險，不需使用色譜技術如高效液相色譜。此外，它還沒有由流動相引起的背景噪音，或基質效應(如MALDI)，而且樣品制備也非常簡單，每孔只需要2-10μL樣品然后進行快速溶劑蒸發。而且不需要在樣品中添加任何的基質.

　　比較

　　選擇一個高通量的前端系統很大程度上取決于三個重要變量：速度，靈敏度，易優化特點。因為激光二極管熱解析不需要物理化學分離，所以它比多維液相要快但不靈敏。激光二極管熱解析處理一個樣品需要7-8秒。而多維液相色譜系統需要25秒。對于許多用戶，這個微不足道的差異可以忽略不計，在1分鐘以內都是可以接受的。

　　雖然激光二極管熱解析方法提供更快的速度，但是沒有物理分離有一個缺點：低靈敏度。例如睪丸酮4-羥基代謝產物和6-羥基代謝產物有同樣的分子量。當用液相色譜時它們只是物理分離，兩個峰有不同的保留時間，使得他們可以清晰的區分開并且實現定量。用激光二極管熱解析進行同樣的實驗時，4-羥基代謝產物和6-羥基代謝產物同時洗脫下來(同時解吸附)，不可能對每個代謝物實現單獨定量。

　　系統易優化的特性是多維液相色譜和激光二極管熱解析又一個不同。系統優化實際上是為了確定理想參數的一個過程。例如對于一個質譜實驗來說，有必要優化S透鏡電壓，碰撞能量，和前體離子和產物離子的分子量。

　　當前端采用多維液相色譜，可用注入模式優化質譜的參數。將化合物以一定速率和濃度泵入質譜中，軟件會自動改變質譜參數，監控結果，自動找到最優的設置。

　　當前端采用激光二極管熱解析，可采用環注射優化獲得最佳質譜參數。由于熱解吸沒有提供一個統一的樣品濃度，用軟件自動優化時是很困難的。在環注射優化模式下，當樣品濃度和質譜參數同時改變的時候，很難確定絕對好的參數。

　　顯然，多維液相色譜和激光二極管熱解析都是不錯的分析方法。哪一個更適合這個問題取決于是實驗室的需求：是追求更快的速度還是追求更好的靈敏度?

　　應用

　　早期評估候選藥物的吸收，分布，代謝和排泄( ADME )是藥物發現的一個必不可少的組成部分。 ADME特征可幫助識別人體藥物代謝動力學好的一面和壞的一面。采用兩種常見的實驗-細胞色素P450和代謝穩定性-比較多維液相色譜和激光二極管熱解析兩種方法。

　　在藥物發現的過程中關鍵一步是鑒別可能的藥物藥物相互作用。主要原因在于這些相互作用的藥物會與細胞色素P450的同功酶發生競爭抑制，這通常用細胞色素P450的抑制方法來檢測。細胞色素P450的檢測方法非常易懂且已標準化，一旦優化好檢測細胞色素P450的探針化合物的質譜參數，就可以很方便的檢測。一次優化針對一個探針化合物，一旦優化好，則不需要更改參數。化合物濃度通常在治療水平。代謝物的濃度非常低，因此需要高靈敏度地方法來進行檢測

　　代謝穩定性試驗是研究隨著時間的推移化合物的代謝，以確定該化合物的體外半衰期。在該方法中化合物的濃度比細胞色素P450濃度要高得多;因此，對靈敏度的要求不是特別大。然而，在一天內需要對多個化合物進行測試，因此每一個都需要優化，因此易優化的特性是非常重要的。

　　激光二極管熱解析在細胞色素P450的應用

　　在最近的一次應用LDTD技術檢測通量能力的實驗中，研究人員用Phytronix Technologies 公司的LDTD源耦合Thermo Scientific三重四級桿質譜儀進行檢測。研究者觀察到8個代謝物。對9個抑制劑濃度進行了測試，在每一個抑制劑濃度下檢測形成的代謝產物。計算了酶活性并繪制成圖。在8個代謝物中，其中有一個由于發生源內裂解沒有鑒定到。在進行LDTD?實驗中，所有9個異構體都放入到同一個樣品中，樣品檢測時間為15秒。

　　在液相色譜-串聯質譜中同樣進行細胞色素抑制試驗，該系統有一個標準、非多維的液相色譜耦合應用生物系統的API4000離子源。樣品根據不同的親油性分為3組。樣品檢測時間為6分鐘。

　　研究人員發現，兩種方法的數據是有可比性的，而且用LDTD系統檢測混合樣品可以減少時間并節省成本。由于樣品檢測的速度大約為15秒，，因此完成96孔板的所有樣品檢測也只需要24分鐘。由于可能的源內裂解，非那西丁形成對乙酰氨基酚，研究人員得出結論，液相色譜串聯質譜(LC-MS/MS)有更大的選擇性。

　　代謝穩定性研究：高效液相色譜和多維高效液相色譜

　　代謝穩定性的定義是母體化合物的百分比在代謝活性測試系統隨時間推移丟失的量。對于代謝穩定實驗，典型的測試系統是肝微粒體，肝S9，肝細胞(貼壁或懸浮)，一般根據實驗目標不同選擇不同的測試系統。

　　為了確定一個新化學實體的代謝穩定性，需要對孵育上清中的候選藥物進行定量，這項工作通常是由高效液相色譜質譜完成。通過了解化合物的代謝穩定性，可以對化合物進行排序，可以使候選藥物由于藥動原因失敗的幾率大大降低。

　　最近的一項研究表明，當進行代謝穩定實驗的時候，通過自動優化和多維液相色譜，通量可以顯著提高。Thermo Scientific Aria TLX-4液相色譜系統，Thermo Scientific QuickQuan 自動優化軟件，在加上TSQ Quantum Ultra?三重四級桿質譜儀可以現在鑒定優化時間，并提高樣品通量，而不犧牲譜圖質量。

　　對8個化合物分別用自動優化和手動優化進行比較，一維液相色譜和多維液相色譜進行比較。采用單高效液相色譜質譜系統和手動優化模式分析樣品;采用四通道多維液相色譜質譜系統和自動優化模式分析樣品。二者的準確度與理論值相比小于10%，精密度RSD<10%。

　　采用手動優化的模式大約花了2個小時，平均15分鐘一個化合物。而自動優化總共才花了16分鐘，平均2分鐘一個化合物。提高了7倍的時間。在單通道液相色譜系統中運行時間需要48個小時。而在四通道多維液相色譜系統只需要12個小時。運行時間提高了4倍。研究者得出結論。自動優化和多維高效液相色譜系統能夠顯著提高通量，而不損失數據質量。

　　結論

　　LDTD和多維液相色譜在藥物發現的實驗中都能提高通量。多維液相色譜提供更高的靈敏度(如細胞色素P450)，并且易于優化，對于每天分析多個樣品是很實用的。LDTD能夠提供高通量，可以使用戶在一天內分析更多的樣品，而且可以快速得到結果。然而，自動優化不是很準確。實驗室必須根據對速度、靈敏度和易用性的要求進行評估。

　　參考文獻

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　　TSQ Quantum Ultra, Aria,和QuickQuan 是賽默飛世爾科技旗下產品。

　　LDTD 是Phytronix Technologies旗下品牌。

　　Thermo Scientific是世界領先的賽默飛世爾科技的重要品牌。

來源：賽默飛世爾科技(Thermo Fisher Scientific)