HPLC的詳細演講稿

上一篇 / 下一篇 2010-01-30 14:10:05

第十三章  高效液相色譜法
第一節概述
高效液相色譜法：以氣相色譜為基礎，在經典液相
色譜實驗和技術基礎上建立的一種液相色譜法
一、HPLC與經典LC區別
主要區別：固定相差別，輸液設備和檢測手段
1．經典LC：僅做為一種分離手段
   柱內徑1~3cm，固定相粒徑>100μm 且不均勻
   常壓輸送流動相
   柱效低（H↑，n↓）
   分析周期長
   無法在線檢測
2．HPLC：分離和分析
   柱內徑2~6mm，固定相粒徑<10μm（球形，勻漿裝柱）
   高壓輸送流動相
   柱效高（H↓，n↑）
   分析時間大大縮短
   可以在線檢測
二、HPLC與GC差別
相同：兼具分離和分析功能，均可以在線檢測
主要差別：分析對象的差別和流動相的差別
1．分析對象
   GC：能氣化、熱穩定性好、且沸點較低的樣品，
            高沸點、揮發性差、熱穩定性差、離子型及
            高聚物的樣品不可檢測
            占有機物的20%
HPLC：溶解后能制成溶液的樣品，
               不受樣品揮發性和熱穩定性的限制
               分子量大、難氣化、熱穩定性差及高分子
               和離子型樣品均可檢測
               用途廣泛，占有機物的80%
續前
2．流動相差別
GC：流動相為惰性氣體
組分與流動相無親合作用力，只與固定相作用
HPLC：流動相為液體
流動相與組分間有親合作用力，為提高柱的選擇性、
  改善分離度增加了因素，對分離起很大作用
流動相種類較多，選擇余地廣
流動相極性和pH值的選擇也對分離起到重要作用
  選用不同比例的兩種或兩種以上液體作為流動相
  可以增大分離選擇性
3．操作條件差別
   GC：加溫操作
   HPLC：室溫；高壓（液體粘度大，峰展寬小）
三、高效液相色譜儀流程圖
續前
四、HPLC的特點和應用
   “三高” “一快” “一廣”
第二節基本理論和條件選擇
一、塔板理論
二、速率理論
三、HPLC法中分離條件的選擇
一、塔板理論
二、速率理論（與GC對比）
續前
討論：
1）流動相流速對HPLC板高的影響（與GC對比）next
2）渦流擴散項及其影響    next
圖示
back
續前
3）傳質阻抗項及其影響
圖示
三、HPLC法中分離條件的選擇
1. 固定相與裝柱方法的選擇：
選粒徑小的、分布均勻的球形固定相（dp≤10μm）
首選化學鍵合相，勻漿法裝柱
2. 流動相及其流速的選擇：
選粘度小、低流速的流動相——甲醇，1ml/min
3. 柱溫的選擇：
   選室溫250C左右
第三節各類高效液相色譜法
一、液固吸附色譜法（LSC）
二、液液分配色譜法（LLC）
三、化學鍵合相色譜法（BPC）

一、液固吸附色譜法（LSC）       流動相為液體，固定相為固體吸附劑
1．分離機制：利用溶質分子占據固定相表面吸附活性
                        中心能力的差異
  分離前提：K不等或k不等
續前
2．固定相：與LC比，固定相粒徑不同（<10μm）
續前
3．流動相：底劑（烷烴）+ 有機極性調節劑
例：正己烷或庚烷 + 氯仿- - -
4．影響k的因素：與固定相性質和流動相性質有關
   溶質分子極性↑，洗脫能力↓，k↑，tR↑
   溶劑系統極性↑，洗脫能力↑，k↓， tR↓
注：調節溶劑極性，可以控制組分的保留時間
5．出柱順序：強極性組分后出柱，弱極性組分先出柱
6．硅膠吸水量↑，LSC→LLC
硅膠含水量較小  吸附色譜  硅膠極性較大
硅膠含水量>17%  分配色譜  硅膠失活→載體
                        吸附的水→固定液
二、液液分配色譜法（LLC）
1．分離機制：利用組分在兩相中溶解度的差異
2．固定相：載體+固定液（物理或機械涂漬法）
  缺點：系統內部壓力大，易流失，不實用
   固定液——極性→NLLC
固定液——非極性→RLLC
3．正相色譜——固定液極性 > 流動相極性（NLLC）
  極性小的組分先出柱，極性大的組分后出柱
適于分離極性組分
   反相色譜——固定液極性 < 流動相極性（RLLC）
  極性大的組分先出柱，極性小的組分后出柱
適于分離非極性組分
三、化學鍵合相色譜法（BPC）
（一）化學鍵合相
（二）反相鍵合相色譜
（三）正相鍵合相色譜
（四）離子對色譜和離子抑制色譜
（一）化學鍵合相
利用化學反應將固定液的官能團鍵合在載體表面
1．分離機制：分配 + 吸附（以LLC為基礎）
2．特點：
  1）不易流失
  2）熱穩定性好
  3）化學性能好
  4）載樣量大
  5）適于梯度洗脫
（二）反相鍵合相色譜
1．分離機制：疏溶劑理論
正相——流動相與溶質排斥力強，作用時間↑
                                                            k↑，組分tR↑
反相——流動相與溶質排斥力弱，作用時間↓，
                                                            k↓，組分tR↓
2．固定相：極性小的烷基鍵合相
   C8柱，C18柱（ODS柱——HPLC約80%問題）
3．流動相：極性大的甲醇-水或乙腈-水
                  流動相極性 > 固定相極性
   底劑 + 有機調節劑（極性調節劑）
例：水  +  甲醇，乙腈，THF
續前
4．流動相極性與k的關系：
   流動相極性↑，洗脫能力↓，k↑，組分tR↑
5．出柱順序：極性大的組分先出柱
                        極性小的組分后出柱
6．適用：非極性~中等極性組分（HPLC80%問題）
（三）正相鍵合相色譜
1．分離機制：溶質分子與固定相之間定向作用力、
                        誘導力、或氫鍵作用力
2．固定相：極性大的氰基或氨基鍵合相
3．流動相：極性小（同LSC）
      底劑  + 有機極性調節劑
例：正己烷  +  氯仿-甲醇，氯仿-乙醇
續前
4．流動相極性與k的關系：
   流動相極性↑，洗脫能力↑，組分tR↓，k↓
5．出柱順序：結構相近組分，極性小的組分先出柱
                                                   極性大的組分后出柱
6．適用：
氰基鍵合相與硅膠的柱選擇性相似（極性稍小）
分離物質也相似
氨基鍵合相與硅膠性質差別大，堿性
分析極性大物質、糖類等
（四）離子對色譜和離子抑制色譜
1．反相離子對色譜法
2．反相離子抑制色譜
1．反相離子對色譜法（IPC或PIC）
反相色譜中，在極性流動相中加入離子對試劑，使被測組分
與其中的反離子形成中性離子對，增加k和tR，以改善分離
1）離子對試劑：烷基磺酸鈉→分析堿
                           四丁基季胺鹽→分析酸
2）影響k的因素
a．與m的極性有關（同反相色譜）
b．與R的鏈長有關：R↑長，極性↓小，tR↑，k↑
3）適用：較強的有機酸、堿
2．反相離子抑制色譜
在反相色譜中，通過加入緩沖溶液調節流動相pH值，抑制
組分解離，增加其k和tR，以達到改善分離的目的
1）離子抑制劑：弱酸、弱堿性物質
                           pH一定的緩沖溶液
2）k的影響因素：與流動相極性有關，還與pH值有關
選擇流動相：應同時考慮極性及pH值
   酸性物質——加入酸HAc tR↑，k↑
   堿性物質——加入堿NH3·H2O  tR↑，k↑
調節pH范圍：3.0~8.0
   pH>8.0 破壞鍵合相與載體的結合
pH<3.0 腐蝕柱子
3）適用：極弱酸堿物質
               pH=3~7弱酸；pH=7~8弱堿；兩性化合物
第四節影響分離的因素
1．
續前
2．對流動相的要求：
1）與固定液不反應
2）對樣品有良好溶解度
   k=1~10
   k=2~5 最理想的
3）與檢測器匹配：
   UV（常用，測定波長應大于溶劑的截止波長）
   熒光，電化學
4）使用粘度小、純度高的流動相（甲醇，乙腈）
   使用前過濾、脫氣
續前
3．洗脫方式
1）等度洗脫（恒組成溶劑洗脫）
   以固定配比的溶劑系統洗脫組分（一個泵）
   類似GC的等溫度洗脫
2）梯度洗脫：
   在一定分析周期內不斷變換流動相的種類和比例
   即不斷改變其極性（兩個泵）
   適于分析極性差別較大的復雜組分
   類似GC的程序升溫（沸程較長樣品）
圖示
第五節高效液相色譜儀
1．泵：
   恒壓泵：流量精度不穩
   恒流泵：常用
2．進樣裝置
1）隔膜進樣（高分子有機硅膠墊→進樣室）
   GC系統壓力較小，可以
   HPLC系統壓力太大，必須停泵進樣（早期）
2）閥進樣：不必停泵，六通閥
續前
3．色譜柱：直徑4~6mm,柱長10~30cm
   柱效評價：色譜系統適應性試驗
                        R，n，fs（拖尾因子）
   柱再生：維護、保養、柱子的沖洗
4．檢測器
  1）紫外檢測器：適于吸收紫外光的物質
  2）熒光檢測器：只能分析自身發光的物質
                              靈敏度高
  3）示差折光檢測器：利用折光率的差別
                                    靈敏度低，溫度要求嚴格
  4）電化學檢測器
  5）化學發光