【回眸2009】手性配體交換色譜法的建立及分離條件優化策略

手性配體交換色譜法的建立及分離條件優化策略

隨著手性藥物研究的廣泛開展，各種手性分離技術應運而生。由于手性藥物對映體生物活性存有顯著差異，因此藥品管理部門明確要求在有關新藥申請報批過程中，必須對光學異構體開展化學（對映體純度鑒別、檢查、含量測定、穩定性考察等）、藥理學（單一構型對映體和消旋體的藥效學、體內體外藥動學、生物利用度等）、毒理學（藥物-藥物相互作用）以及臨床應用等研究。欲開展這些工作，必須首先解決手性化合物拆分問題。因此，建立手性分離分析方法成為開展手性藥物研究過程中的關鍵一環。

在藥物合成反應中，采用適當的手性源來合成光學活性物質是一種重要的方法。氨基酸、氨基醇、羥基酸等作為一種常見易得的手性源在合成含氮、含氧手性化合物的過程中有著廣泛的應用。但由于氨基酸、羥基酸等諸如此類的化合物結構簡單、水溶性強（極性大）、無明顯發色基團等，手性分析中廣泛使用的多糖衍生物固定相正相分離模式難以適用。根據這類化合物的結構特點，本文簡單介紹手性配體交換色譜法的建立及分離條件優化策略。

關鍵詞：手性配體交換色譜法（Chiral ligand-exchange chromatography，CLEC） 氨基酸（Amino Acids）  羥基酸（Hydroxy Acids）  氨基醇（Amino Alcohol ） 二肽（dipeptides）

1.       背景知識介紹——何謂配體交換色譜法？

配體交換色譜（Ligand Exchange Chromatography，LEC），顧名思義，這一技術具有“配位”&“交換”兩大特征，即中心金屬離子(如Cu²⁺、Ni²⁺、Co²⁺等)結合在硅膠（或者聚合物）載體上，待分離物通過與金屬離子的配位（絡合）作用或與金屬離子絡合的配體發生交換而實現分離。

2.       手性配體交換色譜法

手性配體交換色譜法（Chiral ligand-exchange chromatography，CLEC），根據手性配體（手性選擇子）所處環境（流動相或固定相），可分為配體交換手性流動相添加劑法和配體交換手性固定相法兩大類。從手性識別機理來講，氨基酸、羥基酸等待分離物與手性固定相 (CSP)或手性流動相添加劑(CMPA)、中心金屬離子三者形成配位絡合物（非對映體復合物），由于非對映體絡合物相對穩定性不同而致使表現對映體分離的選擇性。

3.       手性配體交換色譜固定相（配體交換型手性柱）

商品化的配體交換型手性柱，通常是以青霉胺或光學純的氨基酸及其衍生物等為手性選擇子（手性配體），通過化學鍵合方式或直接涂敷在ODS硅膠表面（或者聚合物載體上）。在反相模式中通過配位交換相互作用進行手性識別而拆分手性化合物，尤其適用于未衍生化的氨基酸、羥基酸、氨基醇、二肽、二醇、二胺、糖類、核苷、核苷酸及衍生物等有雙配位基的化合物。較常用的商品化配體交換型手性柱有Phenomenex公司的Chirex系列手性柱（比如Chirex 3126）、Sumichiral OA系列手性柱（比如OA-5000）、Astec CLC-D/L 手性柱、Macherey-Nael手性柱（比如Nucleosil Chiral-1）等。

4.  Chiral ligand-exchange chromatography方法建立

手性柱

假定手頭上已有商品化的配體交換型手性柱，面對某一具體待分離物，該如何著手開展Chiral HPLC方法建立呢？

總體原則——手性HPLC與普通C18柱液相色譜分析基本一致——“出得來，分得開，盡量快”。

具體步驟：

第一步：“看”

查看待測物的化學結構（官能團），觀察取代基類型及所處位置（與手性中心距離遠近及空間排列），紫外吸收光譜等。

第二步：“想”

由于CLEC是在反相模式中通過配位交換相互作用進行手性識別而拆分光學物質，因此，在了解待測物化學結構信息后，需盡可能預判該化合物在水溶液或含一定比例有機溶劑的水溶液中的溶解度（涉及到樣品進入手性柱后能否“出得來”）；該化合物與金屬離子形成配位絡合物的能力（關乎于樣品進入手性柱后是否“分得開”）；該化合物的熱穩定性如何，比如在50 ^oC、.60^oC條件下是否穩定等（牽涉到樣品進入手性柱后出來得能否“盡量快”）。

第三步：“做”

對于具體的待分析樣品和已選定的手性柱，分離分析方法的建立與開發主要依賴于流動相條件和/或柱溫。

樣品準備

對于手性分析而言，樣品必須盡可能地“干凈”，通常要求其化學純度在90%以上。具體到CLEC，待測物在流動相中必須有一定的溶解度且越大越好，無機鹽及較樣品極性小的雜質應盡可能地少。與RP-HPLC一樣，盡量用流動相溶解樣品。

流動相

配體交換型手性柱，經常采用含一定摩爾濃度二價金屬離子的水溶液（或添加有甲醇、乙腈、異丙醇等有機溶劑的金屬離子水溶液）為流動相，其中最常用的是CuSO₄水溶液。方法建立過程中可以通過改變中心金屬離子的種類及濃度、調節流動相pH值、優化有機改性劑類型及添加量和柱溫調節等來優化分離方案。需要特別注意的是流動相中必須含有中心金屬離子（通常是銅離子）以確保手性柱固定相上的金屬離子不至于流失，以維持柱穩定性。

柱溫

使用配體交換型手性柱，柱溫通常是方法建立需要考慮的首要問題。從手性分離機理來看，待測物與手性固定相 (CSP)、中心金屬離子三者形成配位絡合物（非對映體復合物），由于非對映體絡合物相對結合強度（相對穩定性）不同而致使表現出對映體的分離。因此，對所有配體交換型手性柱的分離，都要考慮溫度的影響。而且，柱溫與柱壓密切相關。在較高溫度下進行分離，可縮短分析時間，降低柱子反壓。與此同時，在分離過程中高溫有可能導致異構體互變，若兩對異構體峰中間的基線升高很可能是由于手性異構體之間的相互轉變所致。

柱維護

手性柱使用過程中，應嚴格遵循制造商提供的有關有機改性劑類型和濃度的建議，否則可能會導致柱失效。避免使用含有強保留性組分的樣品，建議在手性柱前使用手性預柱加以保護。若由于柱污染而出現峰形變差（前延或嚴重拖尾）時可考慮更換預柱或用制造商指定的最強洗脫溶劑沖洗色譜柱使其恢復。

系統化方法建立及分離條件優化策略

如前面所述，使用配體交換型手性柱分離氨基酸及其結構類似物等對映體，其色譜保留和選擇性可通過改變中心金屬離子的種類及濃度、調節流動相pH值、優化有機改性劑類型及添加量和柱溫調節等來控制。當使用這些柱進行方法建立時就涉及到手性柱選擇、初始流動相條件、柱溫參數等問題。CLEC配體交換手性柱通常使用CuSO₄水溶液作為流動相，Cu²⁺濃度控制在0.2mM-3mM之間，且增加Cu²⁺濃度可以縮短樣品的保留時間；加入有機改性劑（如乙腈、異丙醇、甲醇）可以縮短樣品的保留時間，提高出峰對稱性。 理論上講只要待測物結構中含有兩個合適位置的極性基團，且能夠與銅離子發生配位絡合作用，配體交換柱柱就應該能夠成功地進行手性分離。

采用配體交換型手性柱的方法建立，首先應根據樣品結構（親水性、疏水性）將其歸類，然后選擇相應的方法建立策略。在方法建立時，樣品的溶解度是一個重要參數。

對在反相模式中配位交換手性分離，初始實驗時推薦使用下面的方法建立方案：

4.1. 中心金屬離子的影響  在選定手性柱的前提下，中心金屬離子是決定手性分離選擇性的根本因素。通常采用1.0 mM·L^-1 CuSO₄水溶液或者含一定比例有機改性劑的2.0 mM·L^-1 CuSO₄水溶液（比如2.0 mM·L^-1 CuSO₄ 含10%CH₃CN 的水溶液）。某一具體實驗時最適Cu²⁺濃度應該在0.2mM-3mM之間優化。

4.2. 溫度的影響  待測物、手性固定相、中心金屬離子Cu²⁺三者所形成非對映體配合物的相對穩定性在分離中有重要作用且受溫度的影響。初始實驗時，色譜柱柱溫保持恒定在50 ^oC。柱溫最高不超過60 ^oC。

4.3. 有機改性劑的影響  若樣品溶在水中不能澄清透明，呈渾濁狀（待測物分子結構中含疏水性取代基），則考慮在流動相（CuSO₄水溶液）中添加一定濃度的有機改性劑。比如在2.0 mM·L^-1 CuSO₄水溶液中添加10%CH₃CN（體積比）。加入或增大乙腈、異丙醇、甲醇等有機改性劑濃度可縮短樣品的保留時間，提高出峰的對稱性。乙腈、異丙醇、甲醇等用量不超過15%（體積比）。

4.4. 流動相pH對分離的影響  對于胺、強酸（多個羧基）類化合物，若手性選擇性低且弱保留，可以考慮用冰醋酸或氨水調節流動相pH。配體交換型手性柱在流動相pH 4.5～7.0范圍內穩定。

4.5. 檢測  UV 254nm處檢測。

Chiral HPLC作為一種分離分析技術，與普通液相類似，最常用的檢測器為光電二極管陣列檢測器（PDA/DAD）。（非芳香性）氨基酸等由于沒有明顯的發色基團，常規液相分析在靠近UV末端吸收處190～210nm檢測。手性配體交換色譜分離過程中，由于與銅離子形成絡合物，在254nm有特征吸收，因此，非衍生化的游離氨基酸及其結構類似物可以在UV 254nm處檢測。

采用配體交換型手性柱進行分離流動相組成調節的優化策略

5.        具體操作說明

關于流動相的配制，比如1.0 mM·L^-1 CuSO₄水溶液，即準確稱取無水硫酸銅0.1596g（CuSO₄ 分子量：159.61）溶解于1 L水中，搖勻，0.45um濾過即可。這個比較簡單，通常不會有什么問題。或者用五水硫酸銅來配制亦可。

諸如含10%CH₃CN（體積比）的2.0 mM·L^-1 CuSO₄水溶液作為流動相，這個具體操作起來有兩種方法：方法一：二元泵，一個溶劑通道（A）為2.0 mM·L^-1 CuSO₄水溶液，另一個溶劑通道（B）為CH₃CN，利用泵的精密控制混合功能，A：B=90：10在線混合。方法二：走單泵，分析者按照預定設想手動混合配制流動相，即先準確稱取定量的無水硫酸銅溶于900 mL水中，使其完全溶解，然后邊搖邊緩慢加入100 mLCH₃CN（水與乙腈混合，體積改變忽略不計）。這兩種方法各有利弊：方法一兩相在線混合，有利于方便有機改性劑種類及濃度的調整，但同時在線混合時有金屬離子在泵頭析出的風險；方法二事先人工手動預混合，金屬鹽首先全溶于水，再加入有機溶劑，金屬離子析出的可能性完全可控，但有機溶劑添加量調整不便，若改性劑用量改變，則流動相需要重新配制。

總結

手性配體交換色譜法是目前分離氨基酸、羥基酸、氨基醇、二肽、糖類、核苷、核苷酸及衍生物等帶有雙配位基的手性化合物最有效的方法之一。在選定配體交換型手性柱后，方法建立過程中可通過改變金屬離子的種類及濃度、調節流動相pH值、優化有機改性劑類型及添加量和柱溫調節等來優化分離，以拓展手性柱的使用范圍。