關于蛋白等電點的談論：）

上一篇 / 下一篇 2007-07-19 22:25:33/ 個人分類：蛋白質組

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一個小師妹最近給我發了封信，覺得她的問題比較有代表性，帖出了來供大家討論：
——————————————————————————————————————
XXX:
你好！

  我在用PMF檢索小麥蛋白，但是我檢索到的蛋白的等電點，不符合我在雙向電泳中做出來的。怎么辦？

  謝謝！
                                 XXX
回信（節選）________________________________________________________

  數據庫里的蛋白等電點是理論值，是根據氨基酸序列用相關軟件計算出來的，只是提供一個參考，和實際值應該有出入，可以不管它。

嚴格的講，一個蛋白的等點只能有一個，但用不同的方法去測量會有差別，同一個蛋白的不同空間構像也會引起等電點的改變，情況比較復雜。在二維電泳上，也可能是有蛋白的降解，或是不知道的翻譯后修飾（比如磷酸化），導致等電點發生變化。

回答完畢。如果還有興趣，可以看看科學出版社的《蛋白質化學與蛋白組學》上11頁的“蛋白質的等電點測定”一節。

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TAG: proteome 蛋白質組等電點蛋白質雙向電泳

firefox發布于2007-07-18 00:58:39: 說得好！蛋白質組學分析本身是一個復雜的工作。需要綜合運用各種實驗結果去推斷。其實，我常把蛋白質的鑒定比做公安中識別罪犯。如果，我們只知道一個特征，比如：這個蛋白叫作“張三”，恐怕數據庫檢索的結果給出的有千千萬，如果我們知道更多的特征，這里，我們稱為PMF（指紋），或者更多的關于序列的信息，識別的、尤其是唯一鑒定的可靠性就會大大增強。

snow_white發布于2007-07-18 00:59:46: haha，理論一定要聯系實踐嘛！

mass發布于2007-07-18 01:01:15: 來點基礎的：

等電點：如果調節溶液的PH值使得其中的氨基酸呈電中性，我們把這個PH值稱為氨基酸的等電點：PI。

PI是氨基酸的重要常數之一，它的意義在于，物質在PI處的溶解度最小，是分離純化物質的重要手段。

等電點的計算：對于所有的R基團不解離的氨基酸而言（即解離只發生在α-羧基和α-氨基上），計算起來非常簡單：

PI＝（PK1’+PK2’）/2

若是碰到R基團也解離的，氨基酸就有了多級解離，這個公式就不好用了，比如Lys、Glu、Cys等。aa Cys Asp Glu Lys His ArgPK’α-羧基 1.71 2.69 2.19 2.18 1.82 2.19PK’α-氨基 8.33 9.82 9.67 8.95 9.17 9.04PK’-R-基團 10.78（-SH） 3.86（β-COOH） 4.25（γ- COOH） 10.53（ε-NH2） 6（咪唑基） 12.48（胍基）

在這種情況下可以按下面的步驟來計算：

1）由PK’值判斷解離順序，總是PK1’< PK2’< PK3’< …，即誰的PK’值小，誰就先解離。

2）按照解離順序正確寫出解離方程式：簡式，注意解離基團的正確寫法。

3）找出呈電中性的物質，其左右PK’值的平均值就是氨基酸的等電點：PI＝（PK左’+PK右’）/2

以Lys為例：在黑板上用簡式演示3）
等電點的測定：等電聚焦法：這是一種特殊的電泳，其載體上鋪有連續的PH梯度的緩沖液，然后將氨基酸點樣，只要該處的PH與氨基酸的PI不同，則氨基酸就會帶電，PH值>PI時，aa帶-電；PH值<PI時，aa帶+電。通電后，氨基酸就會移動，直到某處的PH＝PI，氨基酸才呈電中性，不再移動，因此，可以測出PI。

等電點沉淀

所有的氨基酸均為兩性物質，亦即它們至少含有一個酸性基（carboxyl）及一個堿性基（α-amino）。這些可游離的團基在pH變化時，因釋出或接受質子而可充當弱酸或弱堿，其離子化特性與其它物質一樣遵守Henderson-Hasselbalch方程式：

pH = pKa + log10 [未質子化的形式（堿）] / [已質子化的形式（酸）]

即
pH = pKa + log [A-] / [HA]

氨基酸可以三種形式存在，即正電荷（cation）、兩性離子（zwitterion）或雙極性離子（dipolar ion）及負電荷（anion）等三種，若在酸性溶液中帶正電荷，則在堿性溶液中帶負電荷。

若氨基酸在某一pH值下其凈電荷為0，且在電場中不移動時，稱此pH值為它的pI值（等電點）。

因為凈電荷為零，凈電斥力不存在的緣故，大部份蛋白質於等電點的pH值下，其溶解度最小。相反的，當溶液的pH值低於或高於pI，所有蛋白質分子所帶凈電荷必為同號，彼此之間有相斥力，不會凝結。所以，將pH調到等電點的大小，則大部份的蛋白質將會沉淀，這種現象可以應用於估算某蛋白質的等電點。