MALDI-TOF儀器采購淺談

前言

自從基質輔助激光解吸附離子化（MALDI）技術問世以來，已經有近二十年的時間了，并且，如果把引用率作為唯一參考的話，那么這種技術的發展目前還看不出有任何放緩的趨勢；根據PubMed顯示，1990年到1999年涉及MALDI的引用次數為2,096次，而從2000年到現在，引用次數則已達到了11,117次。

在MALDI技術中，樣品（譬如多肽、寡核苷酸或整蛋白的混合物）與基質材料（諸如2,5-二羥基苯甲酸或alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid）混合，然后被點樣到一塊金屬的靶板上，并干燥。當采用激光對樣品進行激發時，基質迅速吸熱，從而導致樣品離子化，其電荷數通常為+1。這些離子經質量分析器解析，通常采用飛行時間（TOF）分析器，即基于離子到達檢測器的時間來確定離子的質量。

應 用

與其他方法相比，MALDI（以及它的姊妹“軟電離”技術，電噴霧離子化）的優勢在于它可以對生物樣品（諸如：蛋白、多肽、多糖和寡核苷酸）進行非破壞電離。當其與具有充分精度的質量分析器聯用時，基于MALDI的儀器即可通過獲得肽質量指紋圖譜來進行蛋白鑒定。而如果是串聯配置（TOF/TOF），MALDI儀器還可以提供蛋白序列數據。總之，MALDI質譜儀已成為了蛋白質組學市場的go-to技術。

按照Applied Biosystems生物標記和蛋白質組學事業部產品市場經理Dominic Gostick的說法，盡管MALDI經常被選擇作為經一維和二維聚丙烯酰胺凝膠處理后的蛋白鑒定工具，但它同時也是傳統的基于ESI的液相色譜工作流的補充，在這方面，MALDI主要是用來分析色譜的流出組分。

“就LC-MALDI質譜儀而言，確實是有一些優勢的”，他認為“如果把LC與分析器分離，那么確實可以在洗脫液中使用三氟乙酸，從而得到更加尖銳的色譜峰，但這樣一來就無法與電噴霧離子化兼容了。再者，把單級MS從串聯MS/MS中分離，那么對于更深入地挖掘，譬如試圖觀測每一個樣品中最大數目的多肽還是具有一個明顯優勢的。”

這是因為，質譜分析與液相色譜分離意味著我們將不再局限于在下一個色譜峰流出之前所獲得的有限信息。

Waters Corporation質譜產品經理Ronan O’Malley也認為，MALDI-TOF質譜儀的價值已超越了蛋白生物化學實驗室。“在蛋白質組學領域，MALDI-TOF確實十分重要，因為沒有其他可替代的方法。不過，這項技術對于寡核苷酸工作同樣具有重要意義，譬如在質量控制方面，此外，對于多糖的鑒定和結構解析，該技術同樣不可或缺。”

在其他的應用方面，包括基因分型和MALDI成像，作為一種分析手段，一個組織樣品中的蛋白或代謝組分的鑒定是通過一束激光掃描樣品的光柵化處理完成的，這一點與點陣式激光打印機很相似：即從左到右，從上到下。


單級還是串聯

也許用戶在采購一臺MALDI-TOF時，需要做出的最大決定就是是否需要串聯式（也就式TOF/TOF）的儀器。

就串聯質譜儀而言，可以選擇一個具有特定質量的母離子（也就是分析的第一階段），然后再將其打碎。它的子離子再被進行第二次質量分析（也就是串聯部分），從獲得的數據中可以揭示分子的結構或序列；而單級TOF儀器則缺乏這種能力（盡管在離子的飛行過程中，由于“后離子源衰減”確實會產生一些碎片）。

盡管對于獲得肽質量指紋圖譜而言，單級的MALDI通常是足夠用了，但如果涉及到測序或結構鑒定，不同形式的串聯能力就是必不可少的了。Gostick表示，在過去的幾年當中，隨著用戶需求的日益復雜，他親眼目睹了相關產品銷售趨勢的變遷。

“當單級MALDI-TOF質譜儀第一次出現在蛋白質組學市場，大部分科研人員鑒別蛋白的方法僅僅是利用經胰蛋白酶分解后的多肽質量，很自然，我們看到了單級儀器銷售的飛速增長，這種增長同時也帶動了二維凝膠產品的相關市場。” Gostick進一步闡述，“但是，當我仔細審視過去幾年中用戶的購買傾向后發現，他們已越來越不滿足于只購買一臺單級的MALDI儀器。除了可以獲得精確的分子量外，他們希望儀器還可以提供更多的功能。”

Applied Biosystems可以提供單級和串聯的儀器，包括單級的Voyager質譜儀（DE-PRO和DE-STR）和4800 MALDI TOF/TOF分析儀。Bruker Daltonics的Ultraflex Ⅲ也采用了串聯TOF的配置。

還有一些公司提供的串聯MALDI儀器則是基于一種混合質量分析器的配置。譬如Applied Biosystems的QSTAR，MALDI源可以作為一個選件配置在四極桿—飛行時間質量分析器上，類似的情況還包括Waters Corporation的MALDI Q-Tof Premier。


直線還是反射式

采購MALDI-TOF質量分析器時，有兩種主要的配置可供選擇：單一直線式，或在飛行管的末端增加一個離子反射器。就單一直線式TOF儀器而言，某些質量相同的離子有時在飛行管中飛行時，其動態能量只有細微的差別，這種情況下，它們達到檢測器的時間也就幾乎相同。而造成的結果就是峰寬變寬，質量準確度和分辨率下降。“反射式”其實是通過一種離子鏡或反射器，讓通過飛行管的離子束反彈回去，再被與離子源相鄰的檢測器接收，也就是對質量相同的離子起到聚焦能量的作用，從而提高分辨率和準確度。

根據Bruker Daltonics銷售和市場部助理副總裁Victor Fursey的看法，從離子分離的角度，反射式提供了“一種雙重夾擊”，也就是同時提供了能量補償和相對于直線模式而言更長的飛行路線。不過他在隨后的補充中也承認，直線式儀器依然會在實驗室中占有一席之地。對于基本的質量控制工作而言，它是一種非常好的分析手段，此外，對于觀測非常大的離子，譬如大的整蛋白，直線式是必不可少的，他表示，“一旦你試圖折返離子或用正交方式進行離子分離，那么離子光學系統處理那些具有相當高荷質比的碎片將會變得非常困難。”

盡管目前大多數MALDI-TOF質譜儀均包括直線和反射式兩種檢測器，但并不絕對。譬如，Bruker Daltonics的microflex LT就只提供直線式配置。


軸向或正交

基于MALDI技術的質譜儀又可以根據其飛行管的幾何構形進一步細分為軸向和正交型儀器。

就軸向型儀器而言，被激光激發的離子在飛行管中是沿著直線飛行（也就是軸向飛行）；而在正交系統中，相對于最初的離子飛行路線，飛行管則被旋轉了90°。

Gostick表示，正交型的優勢在于它使檢測器和離子源分離開來——或者用更加準確的說法，就是不會影響樣品靶位置的多樣化。“不過，在我們的4800上，現在有一種96孔板的尺寸，對于要保持一個全范圍內不變的質量準確度而言，那確實是一個很大的尺寸，”他認為，“稍有誤差就會導致質量準確度的漂移。”O’Malley的看法是，由于組織厚度的差異，MALDI成像同樣也面臨著樣品靶位置的挑戰。

O’Malley認為，“正交型系統測量的是從離子推動器到檢測器之間的飛行時間。”“你不必再考慮從離子源開始的飛行時間，這樣一來，在離子源的任何能量擴散就不會對分辨率以及質量測量產生不利的影響。”其結果是，正交型系統（諸如Waters的MALDI Q-Tof Premier和Perkin Elmer的單級PrOTOF 2000）較之軸向型系統可以提供“在整個質量范圍內的穩定的分辨率，更出色的質量準確度以及更好的長期校正穩定性。”


軟件

沒有高質量的軟件對數據進行分析，那么全球所有的質譜數據都將毫無意義。Gostick認為，“MALDI-TOF的典型目標客戶，他們與生物的聯系應該較之與質譜的聯系更加緊密。”這就意味著軟件應當使得復雜的工作流程容易為那些質譜可能并非是其第二專業的人員所理解。“他們需要的是相對而言易于使用的工具。”

Applied Biosystems最近推出了用于蛋白定量和定性的全新軟件——ProteinPilot。Gostick介紹道，“我們為軟件增加了一些運算法則從而使其更易使用，現在我們尋求關于生物問題的答案，可以讓軟件做出硬判決，而無需再由使用者做出。”

Temple大學Fels研究所的蛋白質組學核心小組的主管Salim Merali表示，其最新的Bruker AutoFlex Ⅱ TOF/TOF所配置的軟件是他喜歡這一系統的原因之一。Merali認為，“它的用戶界面更加友好，使用者可以與儀器直接互動，可以在屏幕上完成對系統的操作，這一點是非常具有吸引力的，簡便，‘傻瓜’，而我們實驗室的其他儀器就略微顯得有些笨拙了。”

O’Malley的看法是，在購買儀器進行決策時，其他一些需要考慮的可變因素還包括通常的一些質譜參數——質量準確性，分辨率和專屬性——還有像母離子分辨率和離子碎裂方式等。

最后，Gostick總結認為，考慮要長遠。不能僅僅因為這種儀器是蛋白質組學工作流程中承擔高通量分析工作的工具，就認為其他用戶在其他應用領域（譬如分析寡核苷酸或糖類）會無所作為。“一般而言，人們采購這種儀器是作為高通量分析工具，但有時候他們也會希望有一些靈活性，因此在采購儀器時他們也會關注一些其他因素。”


實地考察

Vanderbilt大學質譜研究中心的助理教授Shannon Cornett在為其所在的研究小組采購MALDI-TOF儀器前，花了兩年時間走訪了Bruker Daltonics和Applied Biosystems。

“對于我們而言，關鍵的因素是在整個質量范圍內（最高到100,000分子量左右）的靈敏度，”Cornett主要從事對于病變組織樣品的MALDI成像。他把來自于“同一個生物組織”的樣品同時送往兩個公司，然后將它們的分析結果與他利用自己實驗室已有儀器所得的分析結果進行比較。

    在對任何一個質譜廠家做出購買承諾之前，如果可能，你最好能充分利用它們的演示機構，充分利用它們的演示儀器。