MALDI-TOF質譜在腫瘤臨床應用的研究進展 (zt)

腫瘤是一種慢性病，是細胞學明顯改變的結果，也是人的一種整體性疾病。因而比較復雜，雖然經過長期的研究和實踐，對腫瘤的認識取得了很大的進步，但是我們仍然面臨著巨大的挑戰。對于腫瘤預防的基礎認識不夠，早期診斷仍很困難，還存在放化療的敏感性和毒副作用及個體化治療的不理想，更多因為腫瘤的復發和轉移導致治療的失敗等，種種原因使腫瘤的發病率和死亡率沒有明顯下降。而現有的臨床檢測手段還不能很好的解決這些問題，因而急需技術的革新。近年來分子診斷學的發展為腫瘤研究和臨床應用提供了有利的工具，為腫瘤預防，早期診斷和個體化治療提供了新的思路和途徑。并從不同的分子層次(如DNA，RNA，Pr等)來尋找腫瘤標志物，其中，MALDI-TOF質譜扮演了重要的角色。本文就MALDI-TOF質譜技術平臺在腫瘤領域的應用及存在的問題及將來的應用前景作一探討。

1 基于MALDI-TOF質譜的技術平臺

基因序列的變化，基因表達的改變，蛋白結構和功能的變化等與腫瘤的發生發展有密切關系。在后基因組時代，MALDI-TOF質譜對于分析這些分子的變化是非常適合的，能同時在DNA，蛋白，組織等不同層次發揮作用。因而，MALDI- TOF技術在腫瘤臨床具有廣泛的應用價值，該技術的主要幾個技術平臺簡單介紹如下：

1.1 MALDI-TOF技術在DNA分析領域的應用

MALDI- TOF技術在DNA分析領域的應用平臺主要包括SNP，單體圖，甲基化，基因表達和突變檢測等方面[1-2]。與其它DNA分析技術相比，質譜技術通過直接檢測分子量，而不需要熒光或放射性物質。另外，它容易實現高通量，多指標的檢測，因而在時間和費用方面都具有很強的競爭力。近年來，質譜技術廣泛的應用于DNA分析領域[3]。

1.1.1 MALDI-TOF技術在SNP研究領域的應用

在基因分型方面曾經發明了很多方法[4]，而高通量的MALDI-TOF技術體系被認為是最強大和可靠的[5]。經過十多年的發展，通過單堿基或多堿基擴增終止技術(multiple-base extension with specific termination)，實現了多個SNP的同時檢測[6]。Sequenom公司(www.sequenom.com) 利用此技術在SNP分析領域做了大量的工作，他們對10個全基因組進行大規模的SNP掃描，每個基因組檢測28000到91000個SNPs不等，此目的是為了發現一些疾病相關的易感基因[7]。目前，MALDI-TOF技術在SNP分析方面扮演著越來越重要的角色。已經商業化的技術有MassARRAY 系統(Sequenom)和GENOLINKTM(Bruker)等。通過質譜技術研究者發現了SEZ6L基因的一個位點多態性(SNP rs663048)與肺癌的發生風險有密切關系[8]。

1.1.2 MALDI-TOF技術在甲基化研究領域的應用

隨著人類基因組測序的完成，人們開始關注基因功能和調控的研究。DNA甲基化是基因轉錄調控的主要機制之一[9]。遺傳和表觀遺傳改變的累積導致了腫瘤的發生，在這系列事件中，表觀遺傳是比較早期的變化，甲基化往往導致了抑癌基因的失活[10]。另外，甲基化具有腫瘤特異性的模式，其程度往往跟腫瘤的惡性程度有關 [11]。因而，DNA甲基化有可能在腫瘤的分子診斷中發揮作用。

由于在PCR的擴增中，甲基化會丟失，所以在擴增需要固定甲基化狀態，使用最廣泛的方法是用重亞硫酸鹽處理[12]。經過處理后，甲基化了的胞嘧啶在PCR反應中保持不變，而沒有甲基化的胞嘧啶就會變成胸腺嘧啶，這樣甲基化的分析就變成了C/T SNPs的分析。通過質譜可以準確的對DNA甲基化水平進行定量，Tost J等先用亞硫酸氫鹽對基因組DNA進行處理，隨后用GOOD方法能有效的分析單個甲基化情況[13]。也可以實現多個甲基化的平行分析[14]。 Ehrich M 等用堿基特異性剪切擴增產物聯合MALDI-TOF質譜技術，針對47個基因，對48人份的肺癌和正常組織進行定量的甲基化分析，甲基化的結果與組織病理的結果較為一致[15]。進一步的研究發現其中6個基因的甲基化模式能夠區分出非小細胞肺癌，其敏感性和特異性均超過95%，可以作為非細胞肺癌的分子標志[16]。

1.2 MALDI-TOF技術在臨床蛋白組學領域的應用

蛋白質作為功能分子，對細胞功能的影響更加直接，將是一種比較理想的腫瘤標志物的分子體現。MADLI-TOF技術在臨床蛋白組學的研究也是近10年來的事情，比較明顯的進展是Ciphergen的蛋白芯片，Bruker的液體芯片和Intrinsic Bioprobes免疫質譜的發展。

1.2.1 蛋白差異表達檢測

在臨床蛋白組學領域主要發展了蛋白芯片和磁性微球兩項新的分離技術，與MALDI-TOF質譜的聯合推出了兩個商業化的系統: Ciphergen的蛋白芯片檢測系統和Bruker的液體芯片系統，即蛋白質指紋圖譜技術。由于其檢測材料來源廣泛，檢測前被測材料不需特別處理，標本加樣量少(數微升)，且具有技術操作較簡單，可多樣本測定，檢測快速，靈敏性和特異性高等優點，可用于實驗診斷，生物科技，醫學等領域[17]。通過標本收集及實驗的標準化，蛋白質指紋圖譜技術是目前最有希望用于腫瘤早期檢測的檢測方法之一[18]。根據國內外對12種腫瘤血清及尿液檢測結果統計，蛋白質指紋圖譜技術檢測敏感性和特異性均為80%-90%，明顯高于傳統腫瘤標志物的檢測，所以蛋白指紋圖譜技術特別對評估傳統腫瘤標記物陰性的惡性腫瘤有意義 [19]。

1.2.2 免疫質譜

質譜與抗體分離技術聯合應用即為免疫組質譜(Immunomic mass spectrometry, IMS)，蛋白質功能的改變可能來自以下幾方面的原因：編碼該蛋白基因的突變，該基因表達量的改變，蛋白后修飾等。而利用免疫組質譜能一次分析實現遺傳學，蛋白表達和修飾的統一。也可以同時檢測多個生物標志群，是應用于臨床檢測的理想平臺。Ciphergen公司和Bruker公司在這方面都有所發展，而Intrinsic Bioprobes公司自上世紀90年代中以來就專注于免疫質譜的發展[20-21]。 Niederkofler 等人通過免疫質譜實現對血漿中脂蛋白A-I (apoA-I), apoA-II, and apoE的檢測，能夠快速，準確，靈敏的反映各種脂蛋白的變異情況，從而更加精確的反應分子信息與疾病的關系[22]。 Nedelkov等人用五種多抗(2-microglobulin，cystatin C，retinol-binding protein，transferring，transthyretin)對1000個健康人群的血漿進行研究，發現總共存在27種蛋白形式，大多數因為氧化或單個N端氨基酸丟失，點突變和多堿基缺失只在小部分人群中檢測到，其中有兩個蛋白修飾與性別有關[23]。

1.3 MALDI-TOF在組織成像領域的研究進展

MALDI- TOF技術直接分析組織能夠一次顯示500到1000個蛋白信號，它們分子量在2KDa到20KDa上下。近年來該技術也被廣泛的應用于組織成像研究 [24-26]。雖然是一項新技術，但是已經用于研究腫瘤臨床問題，包括非小細胞肺癌，腦腫瘤等[27-28]。通過研究前列腺癌，發現了PCa-24在腫瘤組織中高表達，其將有可能成為前列腺癌的標志物[29]。一些研究者很好的總結了其實驗過程和數據分析及注意事項，包括樣本準備，基質選擇和使用，MALDI分析前的組織染色，質譜成像和數據分析等 [30-31]。與免疫組化方法相比，質譜成像技術能一次分析很多個分子，且不依賴于抗體，同時能夠發現和證明與疾病相關的蛋白。通過與顯微切割技術聯合應用，研究者可以分析少到10到50個純化細胞的分子變化情況[32-34]。

2 MALDI-TOF質譜在不同體液中的研究情況

在DNA，蛋白質水平研究腫瘤的發生發展規律，并在病人外周血、尿、痰、唾液、乳頭分泌液、腦脊髓液等無創或微創樣品中尋找腫瘤特異分子標志已經成為研究熱點,以下主要介紹在外周血，痰液等的研究情況。

2.1 外周血

外周血中蘊涵著豐富的疾病分子信息，用來分析的樣品主要是血漿或血清。由于血液中蛋白質成分復雜，幾個高豐度的蛋白占據了大部分，給分析帶來了一定的困難，近年來發展的Ciphergen的蛋白芯片，Bruker的液體芯片技術等是我們大規模分析外周血蛋白的有力工具。但是血液中蛋白容易受各種因素影響 [35]。因而特別強調標準化問題。Banks等[36]用SELDI-TOFMS技術評價了血液處理過程中對小分子量蛋白組的影響因素，結果發現血液的收集和處理過程(凝集管，凍融次數，存放時間和溫度等)，芯片類型(H50, CM10, IMAC30-Cu)，抗凝劑種類(EDTA, citrate, heparin)等是主要的影響因素。基于質譜的蛋白質組分析，對于用血清還是血漿的問題有一定的爭論。對于小分子量蛋白分析，Tammen等[37]推薦用EDTA或檸檬酸鹽抗凝，且去除了血小板后的血漿。也有研究表示用血清優于血漿，認為血清含有很多的信息[38]。至今，這方面的研究已經有很多。大部分的研究通過比較腫瘤患者和健康人群的血清或血漿的蛋白組差異。一些綜述很好總結了這個領域的進展[39-41]。

2.2 痰液

通過研究痰液可以發現肺癌相關的腫瘤標志物，特別是鱗癌[42]。有研究報道肺癌的痰檢測的敏感性達到65%[43]。Palmisano等[44]發現肺鱗癌患者在臨床檢出前3年就可以在痰液中發現p16 和 O6-MGMT啟動子區的異常甲基化現象。另外，在所有的肺癌類型患者的痰中發現ASC/TMS1蛋白表達降低，痰液中ASC/TMS1基因的超甲基化現象在晚期肺癌患者中普遍存在[45]。這些研究提示通過在痰中檢測基因的甲基化情況對于早期發現肺癌有重要意義。

3 基于MALDI-TOF質譜技術的腫瘤標志物的研究思路

生物標志物是指細胞水平，生化水平或分子水平(蛋白，遺傳，表觀遺傳)的改變，能夠識別和監測正常，異常細胞或生物學過程。這些標志物可以基于 DNA，RNA，蛋白或抗體等。而腫瘤標志物指示腫瘤存在的物質或過程，可以是腫瘤自身分泌的分子或機體對腫瘤的反應。標志物分析可以通過組織，細胞或體液等介質來檢測[46]。如何發現有效的腫瘤標志物，如何把它應用到臨床，如何縮短從研究到臨床的研發時間等，這些都需要我們在一開始研究時就要仔細考慮。而如何保證標本中的分子信息就是人體內的分子信息，如何保證技術檢測到的分子信息就是樣本的分子信息，如何保證從技術檢測的分子信息中得到有用的信息，如何保證數據分析后得到的信息能應用到臨床等，這些都需要考慮標本的收集和處理，實驗的標準化和質量控制等。

從基礎到臨床的轉化研究中急需一系列的標準或指南來指導研究，目的是發現真正有用的標志物。研究人員能夠完全的報道他們的研究結果，包括陰性結果。要建立統一的指南來發表用于篩查，風險評價，預測和疾病監測的標志物。5條基本原則如下：1;標志物研究和應用必須以病人為中心。2;標志物研究的目標是提高患者的療效，通過證明那些病人得益于特殊治療，而另外一些卻沒有。3;標志物研究要有責任心，資源要共享。4;鼓勵研究交流，革新的思路和方法來提高病人生活質量。5;遵守一定的標準和指南來實施研究，報道結果和臨床應用[47]。然而，很多標志物在進行嚴格的評價之前，不適宜在臨床的應用。Pepe等[48]建議通過5個步驟來系統的指導腫瘤標志物的研究，這些步驟包括: (1)發現階段(discovery phase), 如通過比較腫瘤組織和正常組織來發現有差異的分子。 (2) 驗證階段 (validation phase) ，進行臨床分析，包括標本的無創收集。(3) 回顧性研究, 評價標志物對于發現臨床前疾病的能力，要大樣本的收集健康人群并跟蹤直到疾病發生。(4)對無癥狀或高危人群的篩查與跟蹤,評價所選標志物在早期發現腫瘤的能力。 (5)通過大規模的人群篩查能否降低發病率和死亡率。對于有用的標志物，分析方法要有統一標準，這樣的檢測結果能夠被醫務人員準確的利用。高質量的臨床標本和詳細的準確的臨床信息要相配套，標志物通過驗證后，繼續收集臨床數據以提高我們對長期效果的了解和后續的研究。一開始就要有效的設計和系統來保證有效的發現標志物。

4 展望

很難通過單一的標志物達到理想的目的，因為人的年齡，性別，飲食，遺傳等因素都不相同，還有腫瘤的異質性問題。因而需要多個標志物的聯合檢測。而如何找到有聯系的多個標志物組合是我們努力的目標。總得來講是技術平臺(MALDI-TOF質譜技術)，標本類型(外周血，痰液等)，要解決的問題(風險預測，早期診斷，療效預測，監測，預后等)，目標分子和層次(SNP，甲基化，基因表達，蛋白，組織成像等)和數據處理的有機統一。通過結合標本庫和信息庫，來理解各分子間與腫瘤的有機聯系。對于健康人群，高危人群和腫瘤患者要建立各自的分子信息庫，對于個人要動態監控，建立個人的分子信息庫。

由于MALDI-TOF質譜技術可以應用于DNA，蛋白，組織等不同平臺分析，而且具有多指標平衡檢測能力。另外，MALDI-TOF質譜技術也是一種無標記的檢測技術，從而可以降低檢測成本，又具有高靈敏度和高通量的檢測能力等，因而該技術是腫瘤標志物應用于臨床的理想平臺。必將在腫瘤篩查，早期診斷，個體化治療等領域發揮重要的作用。

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