膠質母細胞瘤細胞U - 87 MG的二維和三維VitroGel可調支架培養

膠質母細胞瘤是一種發生在大腦或脊髓的侵襲性癌癥。多年來，為了幫助理解膠質母細胞瘤的發病機制和進展，人們開發了各種膠質母細胞瘤模型。然而，由于促進這種疾病的遺傳和環境因素多種多樣且復雜，以及其起源組織的不確定性，這一過程變得復雜。

各種研究表明，在二維環境中培養的腫瘤細胞在細胞增殖能力、抗凋亡能力、分化能力、侵襲能力甚至生物標志物表達方面表現出明顯的差異。此外，僅僅研究腫瘤來源的細胞是不夠的；腫瘤本質上是三維的，這種形態在腫瘤進展中起著作用，即血管生成，這是惡性腫瘤的關鍵因素。此外，在膠質母細胞瘤中發現了具有類似干細胞特性的癌細胞，它們被認為是導致對常規治療的高抗性和高復發率的原因。因此，準確有效地開發膠質母細胞瘤的治療方法將需要三維模型，這些模型能夠緊密模擬三維腫瘤中表現出的細胞 - 細胞相互作用。

艾美捷-膠質母細胞瘤細胞U - 87 MG細胞是一種人類原發性膠質母細胞瘤細胞系，常用于研究膠質母細胞瘤的因果關系和進展。在這里，我們討論使用我們的二維和三維VitroGel可調支架培養這些細胞的生長情況。

細胞培養

U - 87 MG細胞在添加了10％FBS和1x pen - strep的Eagle最低必需培養基中維持培養。當培養物達到80 - 90％匯合時進行傳代。對于2D水凝膠涂層培養和3D細胞培養，根據用戶手冊，使用VitroGel 3D - RGD和VitroGel RGD - PLUS，如下所述。

2D涂層培養方法

用VitroGel稀釋溶液（類型1）以1:0、1:1和1:3的稀釋度制備2D涂層水凝膠，然后與無細胞的U - 87 MG培養基以4:1的比例混合；向每個24孔板中加入300μL。水凝膠在室溫下穩定20分鐘，然后將細胞添加到懸浮在300μL覆蓋培養基中的水凝膠頂部。每隔一天更換培養基。     

3D涂層培養方法

根據制造商的方案，用VitroGel稀釋溶液（類型1）以1:1和1:3的稀釋度制備水凝膠。對于共聚焦/熒光成像，使用底部有蓋玻片的8孔室培養細胞，每孔使用200μL水凝膠。每隔一天更換培養基。 免疫

熒光（IF）成像

對于IF成像，細胞在有蓋玻片的腔室載玻片上生長，而不是在8孔板上。每個腔室容納200μL水凝膠/細胞混合物。根據制造商的方案，使用Image - iT?固定/透化試劑盒、ActinGreen?488 ReadyProbes?試劑和NucBlue?固定細胞ReadyProbes?試劑（ThermoFisher）對細胞進行固定和染色。使用帶有ZEN軟件和ImageJ的Zeiss Axiovert 200M熒光細胞成像顯微鏡拍攝圖像。

結果：

在2D VitroGel系統上培養U - 87 MG細胞促進球體形態的形成。 為了研究我們的2D VitroGel系統是否有利于U - 87 MG細胞在二維系統中的生長，我們在我們的兩種VitroGel產品的各種稀釋液中培養它們。U - 87 MG細胞從人類膠質母細胞瘤腫瘤中收獲，盡管在標準的2D培養中它們的固有性質是聚集，但它們采用成纖維細胞樣形態，僅形成小聚集體（圖1A）。在VitroGel水凝膠中，細胞表現出更多的球體聚集，即使在較低的稀釋度下（圖1B - E）。在兩種水凝膠的1:3稀釋度下（圖1C，E），形成的集落較小，但在新的更軟的VitroGel RGD - PLUS中，細胞聚集體表現出一種有趣的形態特征：它們在聚集體之間形成橋梁（圖1E）。

圖1：U - 87 MG細胞在VitroGel 3D - RGD和VitroGel RGD - PLUS的2D水凝膠厚涂層表面上生長2天。在1:0稀釋度下，細胞在兩種水凝膠的表面聚集形成球體（B，C）。在1:3稀釋度下（C，E），柔軟的物質有助于細胞在VitroGel RGD - PLUS表面的不同球體之間建立連接（黃色箭頭）。 VitroGel RGD - PLUS在3D培養7天后促進細胞間網絡的發展 為了進一步研究VitroGel RGD - PLUS促進細胞間網絡形成的能力，我們在不同稀釋度的三維培養中培養U - 87 MG細胞。我們發現，在原始VitroGel 3D - RGD的兩種濃度下，細胞都可以在水凝膠中沉淀和生長（第2天，圖2A - B），但在7天后（圖2D - E），它們的總體擴散沒有改變，它們可以形成簇狀結構，但沒有表現出細胞間網絡連接（圖2E）。在VitroGel RGD - PLUS中，細胞不僅在第2天就沉淀到水凝膠中，而且它們表現出與VitroGel 3D - RGD中細胞明顯不同的形態：它們更長，并開始建立細胞間網絡。7天后，它們在3D水凝膠中表現出廣泛的細胞 - 細胞連接（圖2H - I），其簇比VitroGel 3D - RGD中的簇大得多（圖2J）。

圖2：U - 87 MG細胞在VitroGel 3D - RGD和VitroGel RGD - PLUS中培養。細胞可以在兩種水凝膠的1:1和1:3稀釋度的3D水凝膠中生長。細胞在VitroGel 3D - RGD中融入水凝膠（A - D），但無法形成網絡連接（E）。然而，在新的VitroGel RGD - PLUS中，細胞在2天后融入（F - G），但在第7天能夠形成細胞間肌動蛋白連接（H - J）。

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