ELISA在人工合成的連翹苷抗原免疫原性檢測上的應用

連翹苷作為藥用的為木犀科植物連翹的干燥果實的提取物，具有清熱、解毒、散結排膿等功效。進行連翹苷的人工合成，然后進行連翹苷抗原的免疫原性檢測，可為連翹苷的工業化生產提供參考依據。ELISA是當前應用最廣泛的免疫檢測方法，不僅可以用于免疫原性檢測，還可以用于細胞因子檢測。ELISA方法將抗原-抗體反應的特異性與酶對底物高效催化作用結合起來，根據酶作用底物顯色，以顏色變化判斷試驗結果，操作簡便、無污染放射性，故應用廣泛。

在機體中引起特異性免疫應答反應的物質為抗原，免疫原性指的是被注射入動物或人體內后，使其產生循環抗體或改變免疫細胞的反應性。藥物的免疫原性通常是指其誘發抗藥物抗體反應的能力。免疫原性的強弱是生物技術藥物開發的決定因素之一，免疫原性檢測可以評價藥物的安全性。美迪西提供免疫原性試驗服務，主要使用小鼠、大鼠、豚鼠、兔、犬、非人靈長類動物做免疫原性毒性試驗。

1、連翹苷人工抗原的合成
　　采用高碘酸鈉法，將購自某公司的連翹苷（FRn）分別與牛血清白蛋白（BSA）偶聯成人工免疫原，與卵清蛋白（OVA）偶聯成包被原。具體方法如下：準確稱取連翹苷5.0 mg充分溶于1 mL 20%甲醇中，NaIO₄ 8.0 mg充分溶于1 mL蒸餾水中，將二者混合，密封并用錫箔紙包裹避光，室溫下攪拌反應1.5 h，得到連翹苷的氧化產物，成為A液。用0.1 mol?L-1 Na₂CO₃（pH 9.6）調pH至9.0以上。準確稱取BSA/OVA各10.0 mg分別充分溶于1 mL 碳酸鹽緩沖液（CBS）中，成為B液。然后將A液逐滴加入B液中，用0.1 mol?L-1 Na₂CO₃（pH 9.6）再次調pH至9.0以上，封閉并避光，室溫下攪拌6 h或過夜。待上述反應完成后，將反應液轉移至用蒸餾水預處理的透析袋中，攪拌下用蒸餾水透析72 h，中間多次換液。透析后的產物分裝，于-20 ℃保存待用。
2、連翹苷人工抗原的免疫原性檢測

（1）紫外掃描法

用蒸餾水精確配制適宜濃度的FRn與BSA，OVA標準溶液，將待測樣品用蒸餾水稀釋到適宜濃度，用紫外分光光度計測出FRn，BSA，FRn-BSA，FRn-OVA，OVA的全波長圖譜。
（2）薄層色譜法

按2010年版《中國藥典》方法進行。用蒸餾水配制適宜濃度的FRn，BSA，OVA標準溶液，將待測樣品FRn-BSA和FRn-OVA用蒸餾水稀釋到適宜濃度。將標準溶液和待測樣品分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇（8∶1）為展開劑，展開后晾干，噴以10%硫酸-乙醇溶液，加熱到108 ℃顯色。
（3）動物免疫

用FRn-BSA免疫原以背部皮下多點注射免疫的方法免疫5只雄性BALB/c小鼠。初次免疫用等量的弗式完全佐劑充分乳化，免疫劑量為100 μg/只，以后每14 d左右加強免疫1次，改用弗式不完全佐劑乳化抗原，免疫劑量不變。從第3次加強免疫開始后每7 d斷尾取血，之后5 000 r?min-1，離心10 min分離血清，分別編號為1～5。
（4）ELISA法測定血清中的抗體效價

     以FRn-OVA作為包被原，用CBS稀釋至1∶1 000，每孔加100 μL，37 ℃孵育2 h。以PBST洗板，每次5 min，共3次，然后拍干。以10 g?L-1明膠為封閉液，每孔加200 μL，37 ℃孵育1 h。洗板。抗血清稀釋倍數為1 000，2 000，4 000，8 000，16 000，32 000，64 000，128 000倍。以未免疫空白小鼠的血清作為陰性對照，37 ℃孵育1h，洗板。每孔加入100 μL HRP-羊抗鼠二抗（1∶10 000），37 ℃孵育0.5 h，洗板。每孔加入TMB使用液100 μL，37 ℃孵育顯色15 min后每孔加2 mmol?L-1硫酸50 μL終止反應，測定吸光度A450 nm。以同一稀釋倍數下抗血清（P）與陰性血清（N）A450 nm比值（P/N）大于2.1時血清的最大稀釋度定為抗體效價。

（5）icELISA法測定血清中的抗體特異性

 以FRn-OVA作為包被原，用CBS稀釋至1∶1 000，每孔加100 μL，37 ℃孵育2 h。以PBST洗板，每次5 min，共3次，然后拍干。以10 g?L-1明膠為封閉液，每孔加200 μL，37 ℃孵育1 h。洗板。抗血清稀釋倍數為2 000，FRn分別稀釋為100，50，25，12.5，6.25，3，1 mg?L-1和對照值0 mg?L-1，每孔分別加入小分子和抗血清各50 μL。37 ℃孵育1 h，洗板。每孔加入100 μL HRP-羊抗鼠二抗（1∶10 000），37 ℃孵育0.5 h，洗板。每孔加入TMB使用液100 μL，37 ℃孵育顯色15 min后每孔加2 mmol?L-1硫酸50 μL終止反應，測定A450 nm。
3、結果
（1）FRn-BSA，FRn-OVA