體外ADME模型之Caco-2細胞模型可研究藥物吸收

新藥研發階段包括4個重要階段：靶標的確定，模型的建立，先導化合物的發現，先導化合物的優化。在確定好靶標之后，要建立生物學模型如藥物體外ADME模型，主要用于研究藥物吸收、分布、代謝和藥物毒性，以篩選和評價化合物的活性，來提高藥物開發的成功率。“ADME”即“毒藥物動力學”，對于臨床前藥物安全性評價至關重要，美迪西生物制藥在藥物安全性評價方面可提供高質量的數據和快速的周轉期以支持各項藥物安全評價研究。

在各種類型的藥物制劑不斷發展的今天，口服制劑以其方便、安全有效而備受青睞，諸多因素均可影響口服藥物的生物利用度，因而改善藥物吸收和提高生物利用度則成為藥劑工作者潛心研究的課題。由于Caco-2來源于人結腸腺癌細胞，可在培養過程中進行腸細胞分化，Caco-2細胞接種到碳酸聚脂多孔膜等基質上，在培養條件下自發形成有極性的，具微絨毛以及緊密連接等類似于小腸上皮細胞刷狀緣側的分化特征的單細胞層。因此，Caco-2細胞可以模擬小腸上皮細胞，廣泛用于藥物吸收過程中物理和生化屏障的研究。

Caco-2細胞轉運模型是首個被國外制藥企業以及實驗室應用的模擬腸道吸收的藥物篩選模型，已廣泛應用于藥物在小腸吸收的評價和轉運機制研究中，Caco-2細胞的結構和功能類似于人小腸上皮細胞，含有與小腸刷狀邊緣上皮相關的酶系。與正常的成熟小腸上皮細胞在體外培育過程中出現的逆向分化不同，Caco-2細胞在多孔可滲透的聚碳酸酯膜上培養3周后可以自發分化為腸上皮細胞，形成致密的細胞單層，進而可用作腸道轉運模型（如圖）。

Caco-2腸道轉運模型

Caco-2細胞模型培養和驗證方法簡單，與體內動物實驗相比更為方便、經濟。

1、Caco-2細胞培養

1) 采用MEM完全培養液（含10%胎牛血清、1%非必須氨基酸、1%丙酮酸鈉、1%谷氨酰胺和1%青-鏈霉素）在37℃和5% CO2條件下培養Caco-2細胞；

2) 每隔一天更換一次培養液。當細胞匯合程度達80%時，進行細胞傳代。將細胞培養液吸出，用不含Ca2+和 Mg2+離子的HBSS小心清洗2次，加入0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA 混合消化液進行消化；

3) 取細胞適量接種到75 cm2培養瓶繼續培養或進行鋪板操作。

2. Caco-2細胞模型的構建及驗證

1) 收集對數期的Caco-2細胞，用MEM完全培養液將細胞濃度調整為2.0×105 cells/mL；

2) 在Transwell板（聚碳酸酯膜，0.4 μm，1.12 cm2）（圖2）的基底側（Basolateral side）加入1.5 mLMEM完全培養液，在頂側（Apical side）加入細胞懸液0.5 mL；

3) 放入細胞培養箱內培養，每兩天換一次培養液，培養一周后每日換液；

4) 繼續培養至21天；

5) 采用Millicell ERS電阻儀（Millipore公司）測定跨上皮細胞電阻（大于500 Ω?cm2），確定細胞單層的致密性和完整性。

3. 轉運研究

下面以熒光標記的藥物為例，借助激光共聚焦顯微鏡來觀察藥物跨膜轉運。

1) 取出Transwell板進行電阻測定，選擇符合轉運條件的細胞孔（電阻大于500 Ω?cm2）。用預熱（37℃）的Hank’s緩沖液洗2~3 遍，并置37℃孵育平衡20~30 min，吸棄洗液；

2) 分別取0.5 mL熒光標記的藥物溶液加入頂側（Apical side）作為供給液，同時基底側（Basolateral side）加入1.5 mL空白Hank’s 緩沖液作為接收液；

3) 37℃條件下轉運2 h；

4) 轉運結束后移除孔內熒光液，加HBSS小心清洗3次，洗去未進入細胞的熒光染料結束轉運；孔內加適量4%多聚甲醛溶液，室溫下固定20 min；

5) 固定完成后用HBSS清洗3次，加10 μg/mL Hoechst 33258適量，室溫下染核1 h；HBSS清洗3次后，加2滴抗熒光淬滅劑，小心將單層細胞剪下至玻底小皿中，在激光共聚焦顯微鏡下進行Z軸橫切，觀察熒光標記藥物的跨膜過程。

由激光共聚焦顯微鏡拍攝的圖可以看出，帶綠色熒光的藥物A與帶紅色熒光的藥物B在Caco-2細胞模型中的跨膜轉運速率不同，其中藥物A的跨膜轉運速率慢于藥物B，跨膜轉運速率的不同與藥物本身的理化性質密切相關。

除采用熒光標記的藥物進行跨膜轉運研究外，還可以采用非熒光標記的藥物進行跨膜研究，此時測定藥物的跨膜轉運能力就需要借助其他檢測方式來（如高效液相色譜）完成。

 Caco-2細胞模型作為藥物吸收研究的一種快速篩選工具，它可在細胞水平上提供藥物分子透過小腸黏膜的吸收、分布、代謝、轉運以及毒性的綜合信息，為藥物研究提供依據。