一個典型的真核細胞可以包含數以千計的不同蛋白質，一些含量十分豐富，一些僅含有幾個拷貝，為了研究某一個蛋白質，必須先將目的蛋白質從其他細胞組分中分離提純出來，如果打算將目的蛋白應用于下游實驗，那么成功表達重組蛋白是很重要的。倘若在試驗開始時花點時間做好蛋白優化，將會大大增加后續試驗的可行性。
蛋白純化這一過程通常從細胞裂解開始（對于分泌性蛋白質的提純則不需要裂解細胞），通過破壞細胞膜將細胞內含物釋放到溶液中，從而獲得含有目的蛋白質的細胞裂解液，然后通過超速離心將細胞裂解液中膜脂和膜蛋白、細胞器、核酸以及含有可溶蛋白質的混合物。目前我國的一些醫藥研發外包服務公司，例如美迪西生物醫藥提供的就有蛋白純化這一服務項目。首先我們來了解一下蛋白純化的基本步驟：
一、蛋白純化的步驟：
1、首先是材料的預處理及細胞破碎。
分離提純某一種蛋白質時，首先要把蛋白質從組織或細胞中釋放出來并保持原來的天然狀態，不喪失活性。所以要采用適當的方法將組織和細胞破碎。常用的破碎組織細胞的方法有：
（1）利用機械力的剪切作用，使細胞破碎的機械破碎法，常用設備有，高速組織搗碎機、勻漿器、研缽等。
（2）在低滲條件使細胞溶脹而破碎的滲透破碎法。
（3）使生物組織經凍結后，細胞內液結冰膨脹而使細胞脹破的反復凍融法。這種方法相對來說比較簡單方便，但要注意那些對溫度變化敏感的蛋白質不宜采用此法。
（4）使用超聲波震蕩器使細胞膜上所受張力不均而使細胞破碎的超聲波法。
（5）用溶菌酶破壞微生物細胞的酶法等等。
2、蛋白質的抽提，通常選擇適當的緩沖液溶劑把蛋白質提取出來。
抽提所用緩沖液的pH、離子強度、組成成分等條件的選擇應根據欲制備的蛋白質的性質而定。如膜蛋白的抽提，抽提緩沖液中一般要加入表面活性劑（十二烷基磺酸鈉、tritonX-100等），使膜結構破壞，利于蛋白質與膜分離。在抽提過程中，應注意溫度，避免劇烈攪拌等，以防止蛋白質的變性。
3、蛋白質粗制品的獲得。
選用適當的方法將所要的蛋白質與其它雜蛋白分離開來，比較方便的有效方法是根據蛋白質溶解度的差異進行的分離。常用的有下列幾種方法：
（1）等電點沉淀法：不同蛋白質的等電點不同，可用等電點沉淀法使它們相互分離。
（2）鹽析法：不同蛋白質鹽析所需要的鹽飽和度不同，所以可通過調節鹽濃度將目的蛋白沉淀析出。被鹽析沉淀下來的蛋白質仍保持其天然性質，并能再度溶解而不變性。
（3）有機溶劑沉淀法：中性有機溶劑如乙醇、丙酮，它們的介電常數比水低，能使大多數球狀蛋白質在水溶液中的溶解度降低，進而從溶液中沉淀出來，因此可用來沉淀蛋白質。此外，有機溶劑會破壞蛋白質表面的水化層，促使蛋白質分子變得不穩定而析出。由于有機溶劑會使蛋白質變性，使用該法時，要注意在低溫下操作，選擇合適的有機溶劑濃度。
4、樣品的進一步分離純化
用等電點沉淀法、鹽析法所得到的蛋白質一般含有其他蛋白質雜質，須進一步分離提純才能得到有一定純度的樣品。常用的純化方法有：凝膠過濾層析、離子交換纖維素層析、親和層析等等，有時還需要這幾種方法聯合使用才能得到較高純度的蛋白質樣品。其中蛋白質親和層析法通常只需要一步操作便能將目標蛋白從混合物中分離出來，且純度很高，因而備受實驗者的喜愛。在進行重組蛋白表達時，選擇合適的標簽有利于蛋白的純化，促進蛋白的可溶性，因此了解幾種常用的蛋白純化標簽很重要。
二、常用的蛋白純化標簽
1、His標簽
His tag（組氨酸標簽）融合蛋白是目前最常見的表達方式，其優點是標簽小，純化步驟簡便，純化條件溫和，能純化可溶性/包涵體蛋白，一般不會影響蛋白的功能結構，且可以產出大量的目標蛋白，但該標簽不適合易氧化蛋白或膜蛋白的純化。
2、GST標簽
GST tag（谷胱甘肽巰基轉移酶）是最常用的親和層析純化標簽之一，帶有此標簽的重組蛋白可用交聯谷胱甘肽的層析介質純化。它的優點是洗脫條件溫和，有助于保持蛋白功能活性，適合pull-down 檢測，具有很好的線性動態范圍，缺點是分子量較大，可能會影響蛋白質的功能和下游實驗，如果蛋白不可溶，很難用變性的方法進行純化。
3、MBP標簽
MBP tag（麥芽糖結合蛋白標簽）可以減少目標蛋白的降解，增加蛋白的表達量和穩定性，提高表達產物的水溶性，但標簽較大，對蛋白的結構和功能會有一定影響。
4、NusA標簽
NusA tag（轉錄終止/抗終止蛋白標簽）不具有獨立的純化標簽功能，需要和其他標簽（如His標簽）聯用，可提高蛋白質的溶解性，但由于分子量較大，對蛋白下游應用會有影響。
5、Strep標簽
Strep tag（strep標簽）能產出高純度（95%）的目標蛋白，且能保持目標蛋白活性，主要是因其純化流程溫和。其次，能進行變性條件下的純化，在用于WB/ELISA，可偵測目標蛋白；另外，還可固定目標蛋白，檢測蛋白質交互作用，或更進一步用以篩選治療用蛋白質，或是工業用酵素。但Strep tag純化系統的價格相對His tag而言較高，所產出的目標蛋白數相對較少。
6、Flag標簽
Flag標簽蛋白為編碼8個氨基酸的親水性多肽（DYKDDDDK），同時載體中構建的Kozak序列使得帶有Flag的融合蛋白在真核表達系統中表達效率更高。Flag作為標簽蛋白，其融合表達目的蛋白通常不會與目的蛋白相互作用并且通常不會影響目的蛋白的功能、性質，這樣就有利用研究人員對融合蛋白進行下游研究。通過Flag進行親和層析，此層析為非變性純化，可以純化有活性的融合蛋白，并且純化效率高；Flag作為標簽蛋白，其可以被抗Flag的抗體識別；融合在N端的Flag，其可以被腸激酶切除（DDDK），從而得到特異的目的蛋白。因此現Flag標簽已廣泛的應用于蛋白表達、純化、鑒定、功能研究及其蛋白相互作用等相關領域。
三、蛋白純化的3種新標簽
上述的常用的蛋白純白標簽His標簽、GST標簽、MBP標簽等，盡管這些標簽系統各具特色，但它們也分別存在著一些缺陷，還無法完全滿足研究者們的需求。為此，Biotechniques雜志盤點了近期出現的三種新蛋白標簽系統，以便為研究者們提供更大的選擇空間。這三種蛋白便簽系統分別利用了高親和力單抗、無機礦物基質以及能夠剪切標簽的金屬離子。
1、單克隆抗體標簽
日本研究者Yukinari Kato在開發膠質母細胞瘤的治療性抗體時，無意中發現了一個可用作親和標簽的肽段。Podoplanin蛋白是一個在惡性癌細胞中高度表達的跨膜蛋白，Kato生成的大鼠單克隆抗體NZ-1可以靶向該蛋白中一個14個殘基的肽段。他們發現NZ-1與Podoplanin蛋白的親和力特別高，可以將其開發成為一個蛋白標簽系統。研究人員將與NZ-1結合的Podoplanin肽段稱為PA標簽，并將其與現有的其他標簽系統進行比較，發現NZ-1和PA標簽之間的親和力更高，解離更慢。目前他現在正努力將這一標簽系統應用到蛋白質組分析中去，希望能夠用其替代FLAG標簽。
2、磷灰石基質
人們常常用固化的抗體和金屬離子來純化重組蛋白，不過這些方案并不完美，存在著金屬離子析出、穩定性低和成本高等問題。為此，Jacobs大學的Marcelo Fernandez-Lahore用無機礦物氟磷灰石，開發了一個新的親和標簽純化系統。以磷酸鈣為基礎的磷灰石（例如羥磷灰石和氟磷灰石），幾十年來，一直被用作生物分子的吸附劑，其優勢在于這種物質既沒有抗原性也沒有細胞毒性。然而，人們一直未能將它們用于層析法蛋白純化。因為此前的磷灰石基質“顆粒形狀不規則，且在某些條件下很容易溶。Fernandez-Lahore實驗室在這種材料的基礎上，開始尋找與氟磷灰石高度親和的標簽肽段。研究人員通過噬菌體展示篩選，發現肽段KPRSVSG與CFT的結合能力很強，于是他們決定將這個CFT結合肽段（CBP）開發成為蛋白純化的親和標簽。
3、二合一系統
盡管許多蛋白與親和標簽融合后也能夠正常工作，但不少實驗還是要求去除這些標簽。人們往往將剪切位點設計在蛋白標簽旁邊，以便用蛋白酶消化時能夠將其切下來。為了進一步簡化這一過程，哥本哈根大學的Niels ErikM?llegaard提出了一個有趣的新標簽系統。在該系統中，一個分子可以同時實現親和結合和蛋白標簽的剪切，這個分子就是二價鈾酰離子（UO22+）。四年前研究團隊發現，鈾酰可以在蛋白中對磷酸化的絲氨酸進行光切割。研究人員隨即想到，可以合成一個包含特異性磷酸化位點的標簽，使其與固化的鈾酰離子結合，該系統可以在光切割后釋放出純化的無標簽重組蛋白。
美迪西生物醫藥在重組蛋白表達與純化服務方面有10余年經驗積累，美迪西生物醫藥擁有多種蛋白表達系統，包括原核蛋白表達系統、酵母蛋白表達系統、昆蟲細胞蛋白表達系統（桿狀病毒）哺乳動物細胞蛋白表達系統，具備多種融合技術。
