蛋白純化經驗指南

上一篇 / 下一篇 2010-05-26 11:29:31

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1) 我現在手頭有個融合蛋白，純化的時候用助溶劑溶解后做了GST親和層析，之后用蛋白酶切割后卻發現目的蛋白沒有活性。
請問有哪些可能會出現這種原因？怎么解決？測過基因序列，沒有問題。細胞破碎后，融合蛋白在沉淀里，我用助溶劑提取后，可以用GST做親和層析，但效率只有50～60％左右。洗脫完融合蛋白不需要助溶劑，但這樣的條件下切割完后目的蛋白會沉淀，我用0.5％CHAPS助溶可勉強溶解部分，目的蛋白疏水性比較強。

既然是疏水性很強你可以加點甘油或者乙二醇降低極性，這樣溶解就會好得多，此外你也直接加2%的PEG這樣也降低極性，同時保護你的蛋白，你再做純化就可以了，我以前遇到這樣的蛋白是用10%的乙醇加3-5%的PEG5000，這樣的情況下蛋白還是活性回收率很高，我覺得那些表面活性劑能不用還是不用的好，你失去活性你可以監測一下提取，純化，酶切到底哪里失去了活性，這樣更容易解決你的問題。還有注意緩沖液PH值，看看改變它對溶解度有沒有影響。蛋白有沉淀那你可以稍微把蛋白的濃度降低點，這也是個辦法。

2) 請問樓主有沒有合成過配體為FMN的親和膠？

親和的填料合成過20來種,你是希望用它來純化某種脫氫酶嗎,我看FMN可偶聯的有限,倒是FAD有活潑的氨基好偶聯,何況它們幾乎是同一個輔酶,你是不是考慮把 FAD連上去.當然FMN的結構上也有個仲胺,可以偶聯到帶長手臂的環氧活化的填料上,而溴化氰活化或別的活化的介質都不大好,因此我覺得這個沒有什么問題.
此外如果是以FMN為輔酶的,那我還可以建議你試試藍色瓊脂糖凝膠,因為它的配基的結構和FMN的三個環很相似,它能純化不少脫氫酶和激酶.如果它可以你就不需要合成填料了,有現成的.

我已經給你發了相關一些偶聯的材料，請查收，現在一般要自己合成親和填料，有很多公司都提供活化好的介質，自己偶聯就可以，其中比較常用的有溴化氰瓊脂糖凝膠，環氧瓊脂糖凝膠，氨基瓊脂糖凝膠，羧基瓊脂糖凝膠，活化酯瓊脂糖凝膠，以及巰基瓊脂糖凝膠等，但是如果是小分子的配基最好選擇有3-10碳作為手臂的活化介質為好，此外也曾經有文獻報導固定輔酶時，偶聯位置不同，選擇性有差別，因此你可以選擇自己適合的活化介質。
不同的活化的介質對偶聯的配基有不同的要求，所以要對自己的配基了解比較清楚就可以選擇合適的活化介質。

我一般在合成的時候大多選擇環氧瓊脂糖凝膠，它能應用的范圍廣氨基巰基羥基都可以，而且合成的介質剛性好，非特異吸附少，所以不需要特殊處理未反應基團。此外鍵合的鍵很穩定，配基脫落少。我覺得是不錯的選擇。

包涵體的蛋白復性做得不多,但是我記得有個哥們說最管用的辦法也是最簡單的方法,他說在復性的時候盡量別想什么太高難的技術,那些時髦但不一定好用,常用的有透析復性,稀釋復性,包括國外的專家也這么說.我覺得有時候開始摸不出來未必就是方法不行,關鍵要經常改變條件.
層析復性很時髦,但是真正能用的不很多,我覺得蛋白這東西難就在于大多都不相同,所以關鍵要多看文獻,多琢磨自己蛋白的特性,多嘗試。

3) Sephadex G-25（medium）柱脫鹽時，鹽濃度太高對柱效有影響嗎？若有，一般對鹽濃度限度如何？

大家別客氣，除鹽對于濃度應該也是有一定的限制的，同樣的樣品鹽濃度高的自然要比濃度低的要在柱子上走的峰要寬些，相對需要的柱子的分辨率也要高點，但是在正常的范圍如1-2M應該影響不大，不過要除得很干凈還是盡量少上點樣品，我覺得上樣的體積畢竟比濃度的影響更大。

4) 我的蛋白17kd左右，能跟肝素親和，一般用離子交換和親和層析純化，
現在我用聚乙二醇修飾它，分子量增加5000左右，修飾率不可能達到100％，請問修飾后能用什么純化方法可以把修飾的和未經修飾的分開？（當然修飾后還殘留有聚乙二醇，這個小分子也要除掉）
他們大多用凝膠過濾，我覺得這也不錯的做法，畢竟PEG是鏈狀的分子，在柱子上和普通蛋白行為不一樣，修飾度越高那么出峰也越后，因此你的蛋白選擇sephadex G50試試，它的范圍在1000-30000，應該是不錯的選擇。此外PEG是個疏水性的鏈，修飾后的蛋白疏水性增強，修飾度越高，疏水性越強，可以用這個原理分離。離子交換也可以選擇，因為同樣道理，修飾度越高，電荷被屏蔽也越多，電荷也越少，因此應該修飾度越高越先出。親和也離子交換一樣的道理，你可以試試，你手頭的親和能不能分開，你在這幾個方法里選擇看哪個更經濟好用就可以。

5) 我是個新手，謝謝樓主給我解決了許多難題。
我有個問題困繞很久，從細菌中提取酶，好象用常規的方法（超聲波破壁，緩沖液提取），總是拿不到我要的蛋白。是不是這種蛋白也是疏歲水性較強，需要加助溶劑才能提取出來？另外，我是不是也可以加點甘油或者PEG來提取？
其實這個問題我覺得是這樣的，既然你是提取那肯定是有沉淀和上清，你的目標蛋白的分子量你是應該知道的，那么跑電泳先看它到底是在上清還是沉淀里，剩下的問題你再解決如何提取。
對于不同的酶要看酶穩定如何，你可以用不同的 PH去提取，我曾經提取一個酶用水就是提取不出來，需要用鹽才能提取出來，多試試，設計個方案，這樣才能解決問題，所以不一定加甘油就管用，你還得注意破碎本身會不會有問題，倒回去做做也許能找到真正的原因。有什么問題繼續探討。

6) HPLC是用來分析檢測or分離純化？
如果可以用來純化，上樣量那么小有什么意義呢？
如果是用來分析檢測，怎樣指導以后的分離純化工作呢？
HPLC既可以做分析也可以做制備，純化上樣量小，這樣分離效果好，就可能得到很純的物質，同時配合質譜等就何以得到很多單一蛋白的特性包括序列等，這些純度高的組分是用一般的純化方法做不到的。HPLC重現性好,定量準確,所以也可以用于定量和定性,是分析中不可缺少的工具.
分析出來后如果這個物質很穩定，直接線性放大就可以做大規模的制備，因此摸好了分析的條件也就相應有了制備的條件。
7) 利用蔬水性質，用反向HPLC方法分離的原理？（包括洗脫液的選擇和誰先被洗脫下來等），請chromatography兄詳細點。
反相和疏水都是依據物質的極性來純化的，極性越強先出來，極性越弱越后出，洗脫疏水是高鹽吸附低鹽洗脫，反像是極性強的流動相吸附，降低它的極性洗脫，選擇主要是依據填料的特點以及樣品本身的特點而改變的。
疏水的填料疏水集團密度只是反相的10%左右,其他的都是親水的,而反相正好相反,它的表面全是疏水基團,因此疏水一般需要高鹽吸附,低鹽洗脫,反相一般用甲醇水乙睛水吸附,洗脫是逐漸增加有機溶劑的量.由于以上的原因,疏水比反相要溫和,蛋白一般不變性,由于填料多為瓊脂糖凝膠,所以蛋白回收率高,而反相適合做分析多,也有做制備的,那也是一些分子量相對小的多肽,反相的回收率也低, 因為硅膠雜吸附的原因.
疏水色譜是純化蛋白的另一個有力的工具.

8) 求助，我有一段小分子量的蛋白，5KD左右，4對二硫鍵，誘導表達后以包涵體形式存在，請問，我怎么設計我的純化步驟？我用過離子交換柱，純度可以達到 60%，但是不知道下邊該怎么做？望賜教!
這是我的電泳圖譜，第8條泳帶的最下邊就是我的目的蛋白帶，我需要復性，這是一段殺菌蛋白，我要復性之后做抑菌圈。我用的pET-3C的載體，BL21表達
你好，我做復性不多，你可以依據有關有多對4對二硫鍵的蛋白復性的原理看這方面的文獻，我看一般有不少用谷胱甘肽氧化型和還原型配比做的，還有用分子伴侶，你可以多看看再嘗試：）
至于純化，如果你的蛋白有游離的巰基，那我覺得很時候用以前的共價層析，專門對于巰基進行純化，那填料叫71-7105-00 Thiopropyl Sepharose 6B不知道現在還有沒有這個填料，你可以問pHarmacia公司的人。你pM給我，我可以把這個材料發給你，如果沒有，那你只好用離子交換，凝膠過濾，你的既然抗菌，你知道是什么原理，作用于什么部位，和什么結合，那也許可以用親和的方法，我覺得以前說抗生素有的需要疏水結構，你也可以用疏水試試。同時是包涵你可以先把包涵體溶解，然后降低變性劑的濃度，這樣類似分級沉淀，你就可以得到很純的包涵體，再純化就容易了，總之我建議你先分級沉淀包涵體，再做純化。這樣省事點。

9) 我胗靡桓齠屜模?肽）作配基親和純化一個可與它特異性結合的蛋白（67kda），用什么填料比較好，您有什么好的見意？謝謝
對于小分子的配基我覺得需要有一定的親和手臂，否則由于位阻很難有很好的分離效果，說到活化填料的選擇我多說幾句，大多人都會選擇溴化氰，但是這樣做的介質一般雜吸附多，此外沒有親和手臂，所以對于小分子的配基有時候純化效果不好，此外本身對介質也沒有交聯作用，所以剛性也差，如果經常用極端pH洗脫配基脫落也多，這是它的一些缺點。

環氧活化的瓊脂糖凝膠可以有很多的手臂選擇，剛性也好，沒有非特異吸附，形成的鍵比別的活化方法更穩定，因此合成的親和介質性能更出色，你可以選擇這樣的方法，偶聯很簡單，你pM你的郵件給我，我可以把一些材料發給你，供你參考。

10) 我目前作的一個蛋白藥物的分子量大約是7000，等電點4，目前要去除內毒素有何簡單可行的方法？（此蛋白已經純化好，但檢驗內毒素不過關）

你用過分子篩嗎？superdexG75對你這種蛋白比較合適。做之前請先用1MNaOH 1ml/min平衡2小時。這種方法除內毒素，非常有效。
如果問題請與我聯系。myhok@sina.com，我們以前去除都是用去內毒素親和的填料直接加到樣品中震蕩40小時左右,就可以,可以做到<10EU/mg

11) 請問HPLC是在蛋白復性后做比較好，還是在HPLC之后再來復性？？？
復性做得不多,柱上的復性更少,但是就感覺而言還是盡量在柱后復性,因為這樣好放大,而且容易操作,對于HPLC的柱子很容易因為沉淀而堵柱子,包括很高的變性劑對機器也不好,也可能因為流速慢而結晶堵住管道等,很復雜,雖然有一些這樣的例子,但是我覺得真正操作還是麻煩,何況這樣做的量也不大.所以還是選擇純化后復性吧.

12) 我想問問：我把小分子偶連到填料上純化其兔多抗，用什么結合緩沖液和洗脫緩沖液好？
我現在擬的是：
Binding Buffer:
20mM Tris,1M NaCl,pH 8.0
Elution Buffer:
50mM 檸檬酸，pH 3.0
應該沒有問題,如果掛得不好,你可以把Binding Buffer中的1M NaCl去掉,不知道你用什么活化的載體,如果是CNBr,那就得加,但是我們發現有時候鹽也可以洗脫下來東西,你試試再說吧.
洗脫你可以用 pH 5.0 4.0 3都試試,如果在高一點就可以洗下來,沒有必要用太低的,怕對活性有影響

13) 這段在用離子交換柱純化蛋白，我想問一下，洗脫采用的離子強度的大小范圍，應該如何確定，可以根據什么來調整洗脫時的離子強度
一般采用的鹽濃度的范圍在0-2MNaCl之間，怎么確定得配合你的洗脫的峰的電泳結果來確定，最直接的就是你的目標蛋白，如果在很早就出來，那你洗脫的鹽濃度（離子強度）就不用太大，如果出來的很晚或一直沒有出來，那就選擇更高的鹽濃度。
當然你也可以選擇用階段洗脫的方法，這樣比較容易放大，分離效果其實也不錯，雖然摸索要麻煩點，但是重現性好，也一樣可以做得很純，而且能很精確知道在多少濃度下洗脫出來。我比較喜歡用這種洗脫方法

14) 你好：我有一個困惑了好長時間的問題，想請教。我的蛋白是2KD，在做非還原電泳時，發現除了目的蛋白外，有二聚體和多聚體存在。目的蛋白占44%，余下大部分為二聚體和多聚體。但在做反相HPLC時，只出現兩個峰，第一主峰占90%（目的蛋白的位置），出峰時間為13分鐘，第二主峰占10%，出峰時間為 3分鐘。請問在做HPLC時，二聚體和多聚體是否發生改變？用此方法測定含有二聚體和多聚體存在的目的蛋白純度，是否不妥？我用柱子是C4 柱，5υm,300埃。流動相B用0.05%三氟乙酸的乙腈，流動相A用0.05%三氟乙酸的純水。
我覺得蛋白的聚合應該和存在的環境有很大的關系，但是即使如此，那聚合體在反相上能有這么大的差別嗎，你可以用HPLC的凝膠過濾柱子在走一遍試試，或者你把第一個峰和后面的峰都跑電泳看是不是都是蛋白，如果第一個峰也是蛋白，那說明你推斷是對的，如果不是，那就是沒有分開。
我覺得測定聚合體還是用高效凝膠過濾色譜更好點，非還原電泳也應該不錯，反相你可以查查文獻有沒有這么檢測的。
目前檢測protein aggregation的方法主要有四種。
1。gel filtration. 根據專門的mark，可以推斷大致的聚合物的分子量，不過實際應用上看，影響的因素太多了，結果很不精確。
2。 native gel. 大致上可能可以推斷聚合的程度，不過結果實在不能讓人信服。通常要與其他結果配合說明問題。
3。Dynamic light scattering：簡單方便，結果可信，常用于挑選蛋白結晶的條件。但是對于濃度有限制。
4。超高速離心。

文獻中多見1，3聯用，3 explains the status of protein, and 2 explain the status of concentration-dependent aggregation.
有時也見過1，2聯用的，不過僅用于說明次要問題。

15) 請教閣下：我想把一種配基連接到環氧活化的瓊脂糖上制備親合介質，但是這種東西在一定比例的有機溶劑（如二氧六環）和水混合溶液中才溶解，似乎看過文獻提到，有機溶劑會影響瓊脂糖，不知如何處理這個問題？謝謝。
完全沒有問題，因為有些瓊脂糖凝膠活化時就在有機溶劑中，所以它們本身不會影響到活化后的瓊脂糖的，相反在有機溶劑中環氧基團更不容易開環。所以你不用擔心，你的配基穩定的話你可以用0.1MNaOH溶液混合你的有機溶劑室溫偶聯24小時就可以。

16) 最近我在用sephadexG-75的膠純化蛋白，總共膨脹了3次新膠（其中第一次是一個批號，后兩次是同一個批號），第一次是90度9個小時，加 BSA4度過夜，第二次是按照安瑪西亞上的時間90度3小時，還放在120度高壓鍋內滅菌，沒有加BSA，第三次同第一次做法，結果發現，第一次的膠一開始的流速很快，根據說明書上給的線性流速可以達到37cm/h，而且分辨率很高，但后來兩次，線性流速最快的時候也只有17cm/h，分辨率低得多，不知道是什么原因？？？？（我們用的玻璃管都是一樣的型號）

這都很正常的處理應沒有問題,但是還放在120度高壓鍋內滅菌不知道行不行,此外你用什么液體處理的填料呢,pH是在中性嗎,在酸性和堿性條件下有可能會使結構破壞的,你可以測定一下.如果pH沒有問題,那應該說填料本身沒有問題. 至于流速你的樣品會不會比較粘,你柱壓高不高, 如果柱壓高,那填料變形壓縮,那流速自然慢,而且分離效果不好,你的樣品會不會有核酸或多糖,這樣會影響的,因此你還是看看柱床體積有沒有變化,如果縮小很明顯,那你就重新裝柱子.

17) 我們用c-18反向柱純化蛋白，用的流動向是1%三氟乙酸，乙腈，不知道這兩種東西，在什么濃度對蛋白有變性作用。
反相一般都是做分析的多,除非你的蛋白很穩定,否則不大適合做純化,因此在有機溶劑中都有變性的可能,一般10%左右短時間應該沒有問題,高了就很難說了,當然這也很蛋白本身關系很大,如果你真的想純化,那建議還是改C3或C4這樣溫和點,你的有機溶劑也不需要很高的濃度就可以洗脫,也許會好點,你可以配合你的活性測定找到一個合適的濃度使你的蛋白活性回首率更好,純化過程一定要快這樣也降低變性的可能.

18) 我有一單抗腹水，第一次純化時，我先用50％硫酸銨沉淀，然后上HiTrap desalting脫鹽，再過MonoQ強陰離子交換柱，用IFA檢測抗體活性，合并收集峰，最后進行透析。第二次純化時，是直接將腹水上脫鹽柱，沒有經過硫酸銨沉淀，結果兩次純化結果，第二次所的蛋白濃度是第一次的三倍多，純化的抗體我主要是用來做膠體金標記，請問兩種純化過程，對抗體的純度會有什么影響，是否會對標記效果產生差別？
腹水中應該有一些脂溶性物質以及一些別的雜質,沉淀后應該更干凈點,直接過柱子要注意清洗,至于這兩個方法具體效果如何,你可以跑電泳檢測,同時也可以做抗體的活性檢測,如果沒有什么差別,那當然是回收率越高越好. 具體怎么樣只有檢測后才知道.

19) 用HPLC分析得到的結果對我們用普通的層析柱純化有什么指導意義嗎？
我覺得有意義如凝膠過濾的柱子,那可以知道分子量的分布以及別的信息,而如果是反相可以知道哪個蛋白的疏水性強,用離子交換的柱子可以知道電荷的不同,總之了解的信息越多對純化越有用,所以說都是有意義的,只是很少有先做HPLC后做純化的,大多先純化后用HPLC分析.

20) 離子交換層析，一般用氯化鈉洗脫，可以用氯化鈣洗脫嗎？
沒有問題,是鹽都可以,只是小心鈣離子容易和磷酸鹽產生沉淀,你可以用別的緩沖液就沒有問題.

21) 我想請問高效凝膠過濾色譜柱那種比較好，用什么流動相，PH 多少為好？目的蛋白是2KD。
別客氣，其實高效凝膠柱子一般用TSK系列的最多，你可以看看有沒有分離范圍窄點的柱子，只怕難有分離范圍這么小的凝膠柱。流動相用緩沖液就可以。其實按你的分子量，用反相例如C3或者C4更合適，你也可以直接用C18的試試試，凝膠柱很貴，如果用不了那不是可惜了。

補充一下，由于分子量小，可以用MS 來估計disulfide bond是否形成。形成一個，分子量減少2（失去兩個proton）。
至于復性，建議在純化之后進行。有文獻證明，蛋白復性，成功的可能隨純度的提高而提高

因為HPLC用的填料一般是5-10um的,而通常用的填料至少也在35um以上,分離效果差別還是很大的,如果要把這么細的填料裝在普通的柱子上,壓力很大,一般的泵和系統,包括柱子根本承受不了那么大的壓力,此外普通的層析系統的泵的精度管道等都很難保證有很高的分離效果,但是你可以把HPLC的條件直接用普通的填料來放大制備,例如你摸好了HPLC的反相或者親和以及離子交換的填料,如果它們有相應的顆粒大的普通的填料,那就可以直接用HPLC上的條件,這樣只要你HPLC的條件很好,那就可以,但是高效凝膠過濾色譜難在普通的柱子上放大, 它也沒有相應的填料.

22) 你所提及的樣品如含有核酸或多糖會影響sephadexG-75柱的流速及分辨率,具體何解？
我覺得是這樣的：凝膠過濾的原理是小分子能進入的孔到多于大分子的，但是如果有多糖或核酸的干擾（很粘），這樣一些小分子也不能進入更多的孔（和沒有干擾的相比），這樣自然分離效果不如沒有干擾的。這是其一。

其二是由于這些東西粘度大，那么同樣流速下，由于sephadexG-75壓力比平常的大，所以膠會壓縮變形，這樣它的內孔和沒有干擾的排阻極限也不同，所以分離效果自然比沒有干擾要差。特別是壓縮會使孔變得不均勻。
當然相對而言，前面的原因是最主要的，后面是次要的。
其實不僅是凝膠過濾，別的色譜有這兩物質（還有一些脂溶性的物質）也會一樣干擾傳質，因此影響分離效果。所以這兩個東西一般要小心，同時它還會降低柱子的壽命。

23) 我的目的蛋白是以可溶形式表達，MW=６KD,理論等電點為9.45．，無tag．我先用S-100除去了部分雜蛋白，但接著再用陽離子交換柱SP分離（２０mM PB ph=7.00），發現目的蛋白根本掛不上．我想試用硫酸銨分級沉淀除去部分雜蛋白，再過s-100.但不知硫酸銨分級沉淀該如何具體操作？
你可以先把緩沖液pH調到6試試能不能掛柱，此外其實你的蛋白分子量很小，雜質應該大多分子量比它大，你直接過sephadex G50那么大于30kd的很快就出來，或者上superdex 30 大于10KD的先出來，而你要的在后面，然后你再用離子交換試試，S-100分離范圍比較寬，去雜質沒有前面說的那兩種好，此外你凝膠過濾后可能含鹽那也掛不住，因為這樣小的分子鹽會和蛋白一起出來的，你測定樣品的電導看看。
硫酸銨分級沉淀的方法其實很簡單，一般就是用濃度從低到高的硫酸銨去沉淀蛋白，你可以直接在液體里加固體的硫酸銨就可以，到一定的濃度離心沉淀，上清繼續加硫酸銨，再離心，上清再加硫酸銨，你可以設計你的實驗，然后用電泳檢測或者活性檢測沉淀的效果。

24) 如果懷疑是多糖造成的黏度過大，請問應該如何去處多糖？
多糖去除你可以用硫酸銨分級沉淀,也可以用低溫乙醇分級沉淀.一般的多糖也不帶電荷,你可以用離子交換掛住你的蛋白,這樣也是可以的

25) 問一個有關DEAE Sephadex A 50的問題，我的填料處理好后別人拿去用了，用了一次，結果我把他放到燒杯后，發覺已成絮狀，不知有沒有壞掉？可以再用嗎？用什么方法可以把它恢復到原狀？
這個絮狀的東西有顏色嗎，會不會是染菌了，或者是臟的東西沒有處理干凈，你可以用0.5MNaoH泡半小時，沉淀后傾去上清，做三次這樣的處理，如果還有不干凈的東西，你可以用6M鹽酸胍泡半個小時，然后處理和NaoH一樣，再換水，這樣你看能不能洗回來，如果不能很好沉淀下來，那就不能用了。凝膠類的填料很容易長菌，用完得洗干凈，保存在20%的乙醇中。

26) 我想在想純化peg修飾的蛋白，可是我目前只有弱陽離子交換的羧甲基纖維素，你看能不能純化阿，好像文獻上都用sp-sepharose，纖維素是不是不行啊？另外，目前沒有專門的層析裝置和蠕動泵，我用普通的層析柱是不是就可以阿，流量是不是也不用太精確阿？謝謝！

離子交換的方法是可以的，但是我覺得疏水也很值得一做，因為修飾后電荷變化了，其實疏水性也增加了，所以這些方法都可以，此外只要你的CM纖維素能掛住就可以分離，，SP- sepharose只是更強點，而且流速更好點，你先試試，不行再換吧。沒有蠕動泵纖維素流速會比較慢吧，流量肯定不精確，我覺得還是有個泵好點，沒有檢測器也不行，這些是純化的基礎，要不可是比較麻煩的，怕實驗難重復。何況你沒有泵也沒有辦法做線性剃度洗脫。反正是太簡單點。

27) 問一個有關DEAE Sephadex A 50的問題，我的填料處理好后別人拿去用了，用了一次，結果我把他放到燒杯后，發覺已成絮狀，不知有沒有壞掉？可以再用嗎？用什么方法可以把它恢復到原狀？
這個絮狀的東西有顏色嗎，會不會是染菌了，或者是臟的東西沒有處理干凈，你可以用0.5MNaoH泡半小時，沉淀后傾去上清，做三次這樣的處理，如果還有不干凈的東西，你可以用6M鹽酸胍泡半個小時，然后處理和NaoH一樣，再換水，這樣你看能不能洗回來，如果不能很好沉淀下來，那就不能用了。凝膠類的填料很容易長菌，用完得洗干凈，保存在20%的乙醇中。

28) 首先我想問一下agarose和sepharose區別,我的理解是:都指瓊脂糖,但agarose是未連接其他介質的,而sepharose是連接其他介質的,不知理解對不對?請指教!Glutathione-agarose(4%cross-linked beaded agarose)和Glutathione Sepharose 4B是一種東西嗎?
其次,我想問一下你純化過GST融合蛋白沒有?我現純化一個融合蛋白(某種酶和GST融合),我買了SIGMA公司的GLUTATHIONE-AGAROSE五毫升,但我不知怎么做.分子克隆說直接將親和介質于細菌裂解液混允離心....我不知我買的可不可以這樣做.而產品說明書上說做柱子,我就想1毫升的柱子怎么做,裝介質的柱子的高度和直徑有要求嗎?

agarose是通常的瓊脂糖的英文名稱，大家都這么叫，它不是商品的注冊名稱。而sepharose是 amersham的瓊脂糖凝膠的注冊商品名稱。所以你理解是有偏差的，此外agarose不一定是瓊脂糖凝膠，而Glutathione- agarose(4%cross-linked beaded agarose)和Glutathione Sepharose 4B是同一類東西，只是廠家不同。
GST融合蛋白純化過，5ml的凝膠你可以裝在1.6x20的柱子上用，也可以按照分子克隆的做法做，取決于你的喜好和方便。1ml不好裝，除非有專門的小柱子，對于直徑和高度沒有特別的要求，我們的做法是：

1、 GST瓊脂糖凝膠FF裝柱，0.7X2.5cm，柱床體積為1ml；
2、用緩沖液1平衡5個床體積，流速為1ml/min；
3、將10ml發酵液用緩沖液1稀釋到20ml，0.45μm濾膜過濾，上樣。流速為1ml/min；
4、用緩沖液1再洗10個床體積，流速為1ml/min；
5、用緩沖液2洗脫，流速為1ml/min，收集洗脫峰
6、用純水洗5個柱床體積，再用20%的乙醇洗5個柱床體積，流速為1ml/min，柱子置于+4~8℃環境中保存

緩沖液組成：
緩沖液1：20 mM磷酸鹽緩沖液，pH7.4，即pH7.4的PBS溶液。配制：0.2 M NaH2PO4 19ml，0.2 M Na2HPO4 81ml加水至1000ml。
緩沖液2：50mM Tris-鹽酸緩沖液，pH8.0，配制：0.1M Tris 50ml，0.1 M 鹽酸29.2ml，307mg還原型谷胱甘肽，加水至1000ml。

29) 請問con A sepharose 4B 親和凝膠使用前的處理方法？
不需要特別處理，直接平衡后就可以上樣了。
30) 謝謝，我想問一下，是不是離子交換必須要線形梯度洗脫比較好呢？還是階段洗脫好？檢測器我想先收集然后再去測紫外。
也不是,有的時候階段洗脫效果就很好,而且容易放大,不需要儀器,我比較喜歡,效果差不多,但是很省事.但是關鍵是容易重復.紫外分管測定那也可以,我上學也那樣做過.

31) 我要從總蛋白中提出250KD的NF1蛋白做western，由于量少所以要做免疫沉淀。我是利用小鼠來源的NF1單抗與兔抗小鼠IgG、protein A－sepharose來做免疫沉淀，發現做完后跑電泳，出現了兩條帶，分別位于85KD、55KD左右，請問這會是什么東西？會是抗體嗎？還有沒有可能是目標蛋白變小了？

抱歉,我沒有做過免疫沉淀,但是抗體做過一些,抗體重鏈沒有大到85KD的地步,所以應該不是抗體.會不會你的蛋白有四個部分構成,分別是兩個85KD和55KD,這樣分子量正好和你的250KD相當,你可以跑非還原電泳看看,是不是還這樣呢.如果不是,那說明是由這兩個部分組成的.都是由二硫鍵連接的.

32) 我提胰蛋白酶，主要參考用張龍翔書里的辦法，先提卵類粘蛋白，首先過SEPHADEX G-25 柱子脫鹽，然后過DEAE纖維素離子交換柱；第二步是用卵類粘蛋白合成SEPHAROSE-4B親和柱。這些層析過程都可以在緩沖液里面加0.02%的疊氮化鈉抑菌嗎？以后怎樣去除？
我提胰蛋白酶粗酶用的乙醇，可以用異丙醇或正丁醇或其它的低分子醇嗎？濃度多大為好？
那實驗我知道，你用什么方法活化瓊脂糖呢，胰蛋酶的親和純化方法很多，配基有大豆胰蛋白酶抑制劑，抑肽酶，苯甲脒類，特別是后面的苯甲脒，可以買到現成的苯甲脒瓊脂糖凝膠，何必自己去提取呢，感覺比較復雜，自己偶聯這些配基也可以，層析過程不需要加0.02%的疊氮化鈉抑菌，盡量不要加，那透析或者除鹽柱子都可以，或者直接上一樣的親和柱子，用不含這個的緩沖液洗，最后洗脫下來就可以了。
最好還是用乙醇，濃度很難說，因為和你的蛋白濃度有關，別的醇用得很少。此外你可以考慮用硫酸銨沉淀，這樣對活性更好些。純化也可以用疏水，因為它在苯基瓊脂糖凝膠柱子上能被吸附，配合硫酸銨沉淀也是不錯的選擇。

33) 樓主,我想問一下phenyl-sepharose CL-4B有沒有濃縮作用,以前有人做過,克也在純化時,濃縮5-10倍,可是,我卻沒有使純化的蛋白濃縮,我想得到濃度較高的蛋白,又想省去濃縮這步, 樓主能不能指點我一下,緩沖液的流速以及柱子的選擇上有什么要求,使洗脫下來的蛋白濃度會較高,
親和，疏水，離子交換都可以濃縮樣品，但是離子交換是最便宜的，苯基可以濃縮，但是想有好的濃縮效果，最好用一次洗脫或者階段洗脫的方法，我建議你先用離子交換柱子掛住，然后直接用高鹽洗脫，因為不知道你蛋白的等電點，所以不知道你該選什么柱子。如果樣品含鹽高，那可以用疏水，然后直接用緩沖液洗脫就可以。親和也差不多這樣的。流速沒有太大的要求，柱子看你手頭有什么，離子交換是最常用的。上點樣

34) 我做的是青霉素酰化酶,樣品鹽濃度很高,我是兩步純化,第一步使用氧化鋁物理吸附,使用含有1.7mol/L(即200g/L)硫酸銨的 ph7.5,0.05mol/L的磷酸緩沖液洗脫的.第二步想用phenyl-sepharose CL-4B脫鹽和濃縮,可是效果很差,基本是起不到濃縮的作用.
我做了好幾次,都是這樣,可是前面有人做的時候起到濃縮的作用,我現在卻做不出來,也聯系不上以前做過的人.

phenyl-sepharose CL-4B使疏水層析,我現在就這種柱子,我想問的是裝填料的時候用的玻璃柱株高和直徑的比值大的還是小的,洗脫蛋白時會使洗脫的蛋白峰值高一些,謝謝
這個酶純化應該可以用親和的方法做吧,其實只要把青霉素G偶聯到瓊脂糖凝膠上就可以特異用于這個酶的純化.苯基瓊脂糖凝膠濃縮可以,但是除鹽不好,你想濃縮效果好,你可以把硫酸銨的濃度提高到2.5M再掛在柱子上,直接用ph7.5,0.05mol/L的磷酸緩沖液洗就應該可以.你想濃縮的效果好,那盡量用短粗柱子,也就是徑高比大的柱子.這樣擴散少些.此外要用高載量的填料,顆粒細點,起始鹽濃度高點,這樣保證能濃縮好你的樣品.

35) 樓主：這段在用離子交換柱過抗體，請問抗體的吸收圖譜是怎樣的？它的特征吸收峰在哪里，不同的多克隆抗體是不是還有自己的特征吸收峰，
抱歉,你是說色譜圖還是紫外吸收圖呢,蛋白一般都是在280檢測的呀,不同的的蛋白雖然有一點差別,但是那也不是很明顯的,其實就用280就可以了.

36) 我的蛋白以GST融合蛋白的形式表達在E Coli中，分子量14~15kDa，蛋白的疏水性很強，等電點在7左右。菌破碎后，用表面活性劑提取的融合蛋白，據文獻說是由于此蛋白和細胞膜結合，所以如果不加表面活性劑，上清中電泳檢測不到。加表面活性劑后，提取效率還可以。上GST 膠。開始時采用先洗脫融合蛋白，再酶切，洗脫采用10mM GSH洗脫，沒有加表面活性劑。然后酶切后，就會產生大量沉淀，上清中沒有目的蛋白。后來在酶切buffer中也加表面活性劑，就得到了改善，沒有再出現沉淀，目的蛋白也存在于上清中。目的蛋白中僅有一個cys。

我的問題是：
1、老板不知從那看了篇文獻，是專門講此蛋白的結構的。不過人家的蛋白是合成出來的，然后用反相C18（300A孔徑）分離的。他非要我不上GST膠（因為binding 效率不是很高，GST價格很貴，工業化好像也沒幾家），提取液先酶切，沉淀后離心上反相分離。我覺得沉淀中的雜質組成不很清楚，如果有大一點的蛋白變性沉淀之類，用反相會不會很容易堵柱子？我看一些資料，反相只用來分離或分析短肽，較少用于分離較大的蛋白，尤其是我的雜質都不清楚的情況下。
2、過去曾做過superdex200 10/300分離酶切產物時，由于目的蛋白聚集，我也沒有marker，每個峰較難定性，電泳看不出來，可能是濃度太低。我想用反相有沒有可能建立一種便捷的分析方法來分析純化過程中目的蛋白的量？

3、我的蛋白酶什么好的測活方法，只能做細胞毒性試驗。有一篇文獻說在生理條件下，我的蛋白沒有二級結構，盡管在一定濃度下未沉淀，但是都以多聚體存在，如果加入50% TFE(三氟乙醇，trifluorethanol),則可使其在中性pH下恢復二級結構，此時大部分以二聚體存在。那么，你用過TFE防止聚集么？這樣做有什么根據么？好象一般都只用表面活性劑（對細胞有毒性），或L-arg，PEG之類的，可我沒找到在L-arg和PEG存在下，目的蛋白的結構功能方面的文獻。現在不清楚多聚體是否就一定沒有活性？郁悶阿，望多多指教！

4、我的GST結合效率不很高，總有部分流穿（應該沒有超過載量），而放慢流速改觀也不明顯，后來結合的時候binding buffer中也加表面活性劑稍微好一點，但還是不滿意。我曾試過把流穿收集再進GST柱，可是幾乎不結合，所以我懷疑GST部分可能有變性和不變性兩部分。我曾看過一文章，提取時采用離子型表面活性劑，binding時在加入triton X-100，采用混合表面活性劑，據說可以使GST部分復性，增加binding，我還沒有試過。

您有這方面的經驗么？多謝了

1, 其實反相價格會更好點,因為有機器,柱子和流動相也不便宜,其實我們用的是國產的GST融合蛋白的純化系統,價格就不貴,你PM你的郵件給我,我給你一份材料,反相柱子其實做不了多少東西,所以建議你別用它制備.
2.只要你有標準蛋白,那用HPLC做分析代替電泳是很不錯的,因為這樣時間縮短了,效率更高,而且定量很準確.
3.三氟乙醇我的看法是降低了極性,這樣你的蛋白不會因為(環境極性大)疏水相互作用太強和聚集,至于活性那你多查文獻看有沒有別的測法了.
4.至于你柱子掛得少,那有可能是因為有些目標蛋白的結構和能掛上的不一樣,那你可以試試降低上樣的濃度,包括降低疏水性,加表面活性劑看看,這個不做怕是不知道的,因為只要GST沒有活性或被屏蔽,那肯定掛不上.

37) 色譜兄能否推薦幾種不錯的離子交換介質呢？我現在知道有羧甲基纖維素，sp-sepharose等，但是砝碼西亞的sp-sepharose太貴了，450/25ml。你能推薦一下比較不錯的介質嗎？物美價廉的，謝謝！
維素不好操作,還是用瓊脂糖的吧.我用的是國產的.你可PM你的郵件給我.我給你相關的材料.

38) 一是電泳后凝膠里面德蛋白質有什么可靠的方法回收？
二是我現在有個GST融合蛋白，用 thrombin酶切后的目的蛋白條帶很弱，請問可能是什么原因有什么辦法解決

還真沒有做過,你可以用電洗脫的方法,然后濃縮可以用離子交換不就行了或者透析袋加PEG8000濃縮,只怕這樣會變性了.
你酶切帶弱,那可以嘗試增加酶的量,或延長酶切時間,.此外看有pH有沒有問題,你的蛋白濃度是不是太低.

39) 我所說的大顆粒是指蛋白或病毒顆粒。這些顆粒的直徑會大于填料的孔徑。謝謝！

完全沒有問題,我用瓊脂糖凝膠6B給病毒除過鹽,也純化過,這樣可以把很多小分子的蛋白去除,再過離子交換就可以比較純了病毒.病毒都可以,那大分子的蛋白也沒有問題,包括質粒也可以用凝膠過濾純化.

40) 謝謝chromatography的答復。介質有現成的，但很貴啊。我要分離谷胱甘肽還原酶，文獻都是用2',5'-ADP－Sepharose 4B純化，以后你多留意點，　

別客氣,我的意思是你用蘭色瓊脂糖凝膠試試,此外有谷胱甘肽瓊脂糖,應該也可以用來純化谷胱甘肽還原酶吧,或者專門合成一個類似底物的也可以,其實你完全可以自己合成填料的.也許這樣能很好地解決你純化的問題.

41) 我用環氧氯丙烷活化瓊脂糖，到哪兒可以買到現成的苯甲脒瓊脂糖凝膠？GOOGLE 搜不到。我們沒冷室，層析過程加什么來抑菌？我將層析柱放冰箱里層析以防長菌和防酶降解，可以嗎？
環氧活化的瓊脂糖凝膠你要偶聯什么配基呢，我有國產甲脒瓊脂糖凝膠的材料，你pM你的郵件，我把材料發給你，層析過程水是流動的，所以不會長菌，不需要抑菌，層析柱灌滿20%的乙醇，放在冰箱4度中保存很久都沒有問題。

42) 查爾酮合成酶的酶活要用同位素方法測定，而我的條件沒辦法測所以需要送到別的地方測。這會造成很大的麻煩，請問chromatography 有沒有人做過的，有沒有好的方法可以借鑒？另外一個問題是：利用分離純化這個蛋白的填料中有沒有親和偶聯劑？我一直都沒有查到過。
這個酶應該和查爾酮以及苯基酮都有特異的親和力,你完全可以自己合成一些親和填料,我們用的是國產活化好的瓊脂糖凝膠合成不少親和介質,效果不錯,我覺得你可以用親和的辦法,即使是苯基瓊脂糖凝膠也可以純化這個蛋白.因為它和芳香環有很特異親和力.
你說的親和偶聯劑是配基還是活化的填料呢.

43) 請問，如果所提蛋白質濃度低，如何進行濃縮或純化。我試過丙酮沉淀法，但沉淀很難溶解，沒法往下作了。有沒有更好的方法？謝謝！
那你直接把你的樣品放在透析袋中，然后在外面用PEG8000粉末濃縮，這樣就好了，你也可以超濾濃縮。丙酮沉淀要在低溫攪拌情況下緩慢加冷丙酮，避免局部濃度過高，此外沉淀后馬上離心，這樣也可以避免變性而不溶解。

44) 三氟乙醇我的看法是降低了極性,這樣你的蛋白不會因為(環境極性大)疏水相互作用太強和聚集,至于活性那你多查文獻看有沒有別的測法了.

關于TFE對于a-helix的形成，現在有兩種觀點。
1。TFE能穩定a-helix的形成，及這個蛋白本來就是a-helix的結構，但是由于dynamic太嚴重了，或其他的因素，造成表觀上看不見。加入TFE能夠穩定之，使之表觀可見，用CD啊什么可以看得到。
2。TFE能使蛋白變成a-helix。及這個蛋白本來不是a-helix的，但是由于加入TFE的作用，使之變成a-helix。
具體的原理我就沒仔細讀了，不過這兩方都有一定的文獻證明，現在還不知道誰對！ ^_^

45) 我是需要在兔肝中純化一種酶,而且我是剛剛接觸蛋白純化我有幾個問題想請教:
1 : 我的目的蛋白在強陰離子柱上結合(buffer : 25 mM 磷酸鹽 PH 7.4),但是似乎結合力很弱(因為上樣時就有少量蛋白flowthrough,而且洗脫峰在電導值剛開始升高時就開始出現了),我換用了20mM Tris PH 8.2 buffer 之后,蛋白的結合力好像還是很弱,洗脫峰沒多大改變.請問我用 PH 8.5 Tris buffer 會改善我的問題么?
2: 由于目的蛋白豐度低易失活,而且實驗室濃縮的條件有限,我過了脫鹽柱和粒子柱后樣品蛋白含量低體積大,我想請教:我接下來大體積上疏水柱能行么?會很大的影響我的分辨率么?我的蛋白在疏水柱上結合力很強,總是到梯度最末才洗出來,我該怎樣優化一下?
3:我有親和膠(red A) ,但是由于經濟上的原因不能用特異的含配體的溶液洗脫,只好用高鹽的洗脫液(含2M KCl),這樣是不是分離效果很差?值得我去用梯度洗脫么?(因為我沒有空柱,上不了機器,只能用手工做,這樣做梯度很是麻煩)
4:天然的肝臟勻漿梯度離心后,在PH 7.4 的磷酸鹽平衡液下,為什么絕大部分(95%以上)蛋白都結合不上去呢?我最好要把PH值降到多少去試?6.8合適么?
謝謝你的指導!!
1.你可以用5-10mM緩沖液上柱子,同時pH調為8.5,這樣可能會好些,此外如果還是很弱,那你可以用Q柱試試.提高pH 應該有用,但是有的蛋白吸附力弱,所以鹽一高掛不住,因此要降低到5-10mM也許能更好點.
2.大體積直接上疏水沒有問題,既然你的目標蛋白是最后出來,那你可以用0.5-1M鹽洗去雜質,然后用0.1M洗脫,根本不需要走梯度,這樣快,分離效果也不差,而且這樣洗脫的體積小,容易放大.
3. 你說的Red A 是procion red HE-3B嗎,是染料親和嗎,既然這個填料可以,那么藍色瓊脂糖凝膠也可以,它們都屬于染料親和,這個應該更便宜點,洗脫用鹽沒有關系,不需要競爭洗脫, 何況那樣染料很難去干凈.手工洗脫,你可以用階段洗脫的方法,如你用0.5,1,1.5,2M的鹽階段洗脫就可以,不需要走梯度,只要你多摸索,你會找到個合適的濃度,效果一樣很好,沒有問題.
4.掛不上你是指的親和還是離子交換呢,我想如果是親和,那你可以降低pH,同時還一個緩沖體系,我覺得主要在pH,你降低到4-5那掛得就比較好一些吧.

46) 1.我正是用的Q柱出現的上述問題,
2. red A 確實是一種染料親和,
3.我說的掛不上是在souce 30 S 和streamline sp上樣的體積
4.你用akta的設備么?我用purifier 100 ,發現電導值總是稍遲于開始的梯度.

1,那你按我提議試試吧,降低緩沖液濃度,提高pH值.
2. 那它的結構和我說的那個染料是一樣的嗎,你也可以試試藍色瓊脂糖凝膠,都是顏料,結構也相似.
3,掛不上那也可能,不知道你掛的是用什么條件, 這個酶等電點是多少呢.
4.AKTA就是那樣的,因為梯度是從一開始就算,而電導至少要近一個柱床體積才有變化,所以稍遲.

47) 你可以先把緩沖液pH調到6試試能不能掛柱，此外其實你的蛋白分子量很小，雜質應該大多分子量比它大，你直接過sephadex G50那么大于30kd的很快就出來，或者上superdex 30 大于10KD的先出來，而你要的在后面，然后你再用離子交換試試，S-100分離范圍比較寬，去雜質沒有前面說的那兩種好，此外你凝膠過濾后可能含鹽那也掛不住，因為這樣小的分子鹽會和蛋白一起出來的，你測定樣品的電導看看。
硫酸銨分級沉淀的方法其實很簡單，一般就是用濃度從低到高的硫酸銨去沉淀蛋白，你可以直接在液體里加固體的硫酸銨就可以，到一定的濃度離心沉淀，上清繼續加硫酸銨，再離心，上清再加硫酸銨，你可以設計你的實驗，然后用電泳檢測或者活性檢測沉淀的效果。

多謝你的回復，但是我把緩沖液PH 調到5.6，我的目的蛋白仍掛不上 SP柱（我是一個新手，正在做蛋白純化．我的目的蛋白是以可溶形式表達，MW=６KD,理論等電點為9.45．，無tag．我先用S-100除去了部分雜蛋白，但接著再用陽離子交換柱SP分離（２０mM PB ph=7.00），發現目的蛋白根本掛不上．），是不是理論IP與實際有相差？

48) 有可能還在柱子上,如果你所有的組分都檢測了沒有活性,那這樣的可能性很大,你可以用0.5,1M的NaCl分別洗脫,再測定這兩個洗脫組分的活性看看. 你的酶穩定嗎.
我的酶還算比較穩定，４C下活性至少三天不喪失，也有報道一周不改變，－２０C時間就更長了。

49) 問一個可能是比較業余的問題，現在我想通過真核表到得到純的蛋白，然后打單抗，但是很多人告訴我真核表達最大的問題就是得到的蛋白非常難純化，很多人都這樣說，所以科室里就沒有人去試，實際上我覺得通過真核表達得到純蛋白是最好的途徑，所以想問一下，怎么樣能把真核表達的蛋白純化出來，謝謝。

50) 多謝你的回復，但是我把緩沖液PH 調到5.6，我的目的蛋白仍掛不上 SP柱（我是一個新手，正在做蛋白純化．我的目的蛋白是以可溶形式表達，MW=６KD,理論等電點為9.45．，無tag．我先用S-100除去了部分雜蛋白，但接著再用陽離子交換柱SP分離（２０mM PB ph=7.00），發現目的蛋白根本掛不上．），是不是理論IP與實際有相差?

理論上的和實際是有差別，但是不會這么大，你的樣品中鹽的含量高不高呢，有鹽也會掛不住的。

51) 我的酶還算比較穩定，４C下活性至少三天不喪失，也有報道一周不改變，－２０C時間就更長了。
我分別用了０．５Ｍ，１Ｍ的NaCl洗柱子，測蛋白濃度還是很低，中間有幾個管濃度較高，然后測酶活卻發現活性依然很低，上柱前測的還有４４１IU／１０ｕｌ，而收集管里的頂多只有２０IU／５０ｕｌ。
所以，我很懷疑它到底掛在柱子上沒有，于是我檢測了一下上柱后用初始緩沖液洗脫下來的收集液，發現酶活居然有１００IU／５０ｕｌ，我想是不是初始緩沖液的離子強度就太高了呢，０．０１１Ｍ檸檬酸－氫氧化鈉，PH５．５？然后就用的是手工步進式洗脫，０．０５Ｍ，０．１Ｍ，０．１５Ｍ，０．２Ｍ，０．２５ＭNaCl，直到后來的０．５Ｍ，１Ｍ．
另外，我還想請教您：
陽離子層析柱用完后如何保存？先用１M氫氧化鈉溶液，然后再用含硫柳汞的緩沖液，行嗎？可不可以用其他的防腐劑呢？如有，可否推薦一下？硫柳汞我這里包裝大，２５ｇ，又不能分裝，需要避光保存，先謝謝了！

那用更高點的鹽洗脫看看，例如2M，如果還是沒有下來，那也許是沉淀在柱子上了，可是如果吸附，你的穿透應該活性很小才是，可是穿透好象有不少，是不是沒有掛住呢。
保存你用20%的乙醇過柱子就可以，然后在低溫4-8度就可以，沒有必要用硫柳汞。

52) 問一個可能是比較業余的問題，現在我想通過真核表到得到純的蛋白，然后打單抗，但是很多人告訴我真核表達最大的問題就是得到的蛋白非常難純化，很多人都這樣說，所以科室里就沒有人去試，實際上我覺得通過真核表達得到純蛋白是最好的途徑，所以想問一下，怎么樣能把真核表達的蛋白純化出來，謝謝。
純化和表達系統有一些關系，但是最重要的還是看蛋白的特性，所以不一定真核就不好純化，所以我覺得不用擔心。純化的方法你可以用離子交換等純化方法，具體很難說，得看你的目標蛋白而定。

53) 你好,我想請教一下,我現在在做包涵體蛋白的柱上復性和純化,是上的疏水柱.疏水上柱要求硫酸銨的濃度在1.75M以上,但是高濃度的硫酸銨在6M的鹽酸胍中不能溶解,不知道你是否碰到過這類問題.而且我的蛋白又不能用8M的尿素溶解.緩沖液現在用的是50mM的磷酸二氫鈉,PH7.5.還想請教一下,上樣的濃度有要求么?不知道你有什么好的建議呢,謝謝.
要復性你的蛋白濃度就不能高，這樣你溶解你的目標蛋白也就不需要那么高的鹽酸胍了，這樣你就可以把鹽濃度提高點。上樣濃度應該小于0.1mg/ml，具體情況得看你的蛋白，我建議你可以用簡單點的稀釋復性或者透析試試，如果不是特別復雜的復性最好能用簡單的方法，別過柱子。

54) 不好意思，什么叫穿透啊？不懂唉，請指教。
另外，我還想問一下“交換纖維素解離基團的pK值”？，“用陰離子交換纖維素時要選用低于pK值的緩沖液，用陽離子交換纖維素時要選用高于pK值的緩沖液。”是什么意思，謝謝！

所謂穿透就是上樣后用及平衡緩沖液洗下來沒有被吸附的部分叫穿透,pK值用于表示酸堿性的強弱,陰離子交換的填料是堿性的,所以你需要用用緩沖液pH小于 pK值這樣它才能帶正電荷,用于交換帶負電荷的樣品,否則就掛不上樣品.而陽離子是需要緩沖液pH高于pK值,這樣它才能解離帶負電荷,用于吸附帶正電荷的樣品.否則也掛不住.

55) 我做得GST融合純化，目的蛋白在66KD附近，但每次純化出來的總有雜帶，特別是最近的一條帶，濃度較大，不論降溫還是改變誘導劑濃度始終去不掉，您有什么高見，謝謝。
這樣純化的蛋白可以免疫動物,沒有問題

56) 向您請教一個問題，我用pET28載體、宿主菌BL21(DE3)表達目的蛋白，目的蛋白的兩端都帶His-tag,蛋白的大小為37kD，在利用Ni- NTA純化時總是在目的蛋白帶旁邊伴隨一條帶去除不了，請問有什么高招可以解決這個問題？!!!此外，該表達產物為包涵體，請問這種產物可不可以直接用來制備抗體？謝謝！！！

也許這兩個都是你要的目標蛋白呢,會不會是這樣呢,你可以用his的抗體做WB看看是不是這樣的,如果是,那說明是這樣的情況.此外你可以再平衡緩沖液中加0.5%的吐溫等表面活性劑,這樣可以去除一些非特異吸附,此外你可以用pH45左右的變性溶液去洗,這樣也能去掉一些雜質,最后在用咪唑溶液洗脫.如果你這樣都去不掉,而做WB也有兩條帶,那說明可能是降解,超聲破碎的時候功率別太大,時間也別太長,注意溫度, 因為超聲有時候也可能會使蛋白降解.

57) 我做得GST融合純化，目的蛋白在66KD附近，但每次純化出來的總有雜帶，特別是最近的一條帶，濃度較大，不論降溫還是改變誘導劑濃度始終去不掉，您有什么高見，謝謝。
你可以在你的平衡緩沖液里加一些鹽,0.2-0.5MNaCl,這樣可以降低一些因為離子作用帶來的非特異吸附.同時在平衡液里加0.5%吐溫等表面活性劑,這樣是不是有點改善,此外你也可以用階段洗脫的方法,例如用5mM和10mM還原谷胱甘肽去分別去洗脫,這樣看看有沒有什么區別.此外還要注意的問題是超聲破碎時注意功率和時間.避免過強時間過長,降解蛋白.
此外你可以GST抗體做WB看是不兩個都是你要的東西，會不會是降解或造成這樣的結果。你可以加點酶的抑制劑，此外抱歉我不是主任，嘿嘿。

58) 我準備用30％－60％硫酸銨沉淀透析、離心后去上phenyl－sephorase柱。但發現活性大部分還在沉淀中。測了一下蛋白濃度是 20mg/ml。是不是濃度太高啊？
30％－60％硫酸銨沉淀可能對你的目的蛋白來講，太粗略了，如你所言，目的蛋白可能在沉淀中，可否分級沉淀，３０％－５０％，５０％－６０％，再測一下活性可能就分開了，20mg/ml的蛋白濃度對于層析是有點高，洗脫液濃度變化或PH的改變都會使蛋白有損失，最好不要超過１０mg/ml。

59) 我的蛋白是用pGEX-4T載體在BL21中表達的，表達量很高，形成包涵體，為了獲得可溶性蛋白，我現在嘗試用較低濃度的誘導劑誘導，此前用不同濃度誘導做過對比，電泳后表達量的差異不大；但當我再降低溫度誘導后發現，超聲處理后的上清液中目的蛋白條帶很微弱，大部分目的蛋白還是在沉淀中；這和我降低誘導劑前做的不一樣（同溫度），為什么目的蛋白的可溶表達會不穩定呢？對同一菌種應該是固定的吧？我很迷惑．
另外，請問，一般情況下２８度，３０度誘導時間應該分別多少才合適？我們的光度計出了點問題，無法測定ＯＤ值．謝謝．
還有，你有沒有較好的蛋白純化的文獻介紹幾篇，好嗎？

60) chromatography 兄，請教一個問題:
選擇填料的時候，CM和SP怎么選擇？什么時候選擇弱陽？什么時候選擇強陽？
再問一個：
我們實驗室有兩種蛋白，一種等電點5左右，另一種等電點9左右，為什么都可以用CM陽離子交換純化？（用的緩沖液都呈中性）
等電點5的那個我覺得選擇陰離子交換柱好些，為什么不這樣？
沒有什么特別的原則，重要是純化的效果好就可以，一般都是先選擇弱的．
純化是把目標蛋白和雜質分開就可以，所以其實在這樣的情況下，酸性蛋白是掛在陰離子柱上，而后面的掛不住，但是只要能把它們和雜質分開就可以．所以酸性蛋白流穿，雜質被吸附也可以，所以不一定非要吸附也可以．

61) 我準備用30％－60％硫酸銨沉淀透析、離心后去上phenyl－sephorase柱。但發現活性大部分還在沉淀中。測了一下蛋白濃度是 20mg/ml。是不是濃度太高啊？

也不是，其實沉淀你可以做仔細點，例如先用３０％沉淀，取上清，再把上清加到４０％，然后如此類推，一直到６０％，然后測定沉淀和最后上清的活性，這樣就知道哪樣的濃度沉淀效果比較好，既然你的活性都在沉淀里，那直接溶解在一定濃度的鹽中，直接過濾上柱子就可以，濃度高也沒有關系．

62) 急問：我的樣品蛋白液本來放在４C保存，誰知有人把溫度調到了１８C已有一天，請問這樣對蛋白會有多大影響？我純化的是一種酶。另外，樹脂在這樣的溫度下性質會有所改變嗎？某人說４C－３０C的情況下，樹脂不會有太大改變。是這樣么？謝謝！
不知道你的蛋白穩定不穩定，你可以測定一下活性看看，如果沒有什么變化，那就沒有關系，樹脂不會因為溫度有什么變化的，尤其是你的樹脂不是以蛋白為配基的親和填料．，沒錯在４C－３０C的情況下是沒有多少改變，但是那也看多長時間，什么樹脂，因為時間長會長菌如果不加抑菌措施的話．

63) 我用鼎國的sepharose 4-B 合成親和柱可以嗎？
是活化好的嗎，還是普通的瓊脂糖，他們的填料顆粒有的比較粗，不知道你選擇的粒徑是多少范圍的，最好要細一些，４５－１６５um比較好，用一般應該沒有問題．

64) 比如說，sephadex G-25的分級范圍是1000～5000，我想問一下，分子量小于1000的分子（例如鹽）是怎么樣通過的？它是從凝膠內部通過嗎？不是說只有 1000～5000大小的分子從凝膠內部通過嗎？
凝膠的中間有的是大小不同的孔,鹽自然在這些孔中間通過,而所謂的分離范圍也只是說在這樣的分子范圍內有差別,離開這個范圍就沒有分離效果,所以小的和大的都沒有什么分離效果,因此不是只有1000～5000大小的分子從凝膠內部通過.而是在這個范圍的分子有分離效果.

65) 請教：要從發酵液中純化出一個分子量約為1100的具有抗菌活性7肽，前期的提取采用的是酸沉醇提的方法，粗提物中蛋白含量39mg/ml。資料上說，純化這個小肽要用sephadexLH-20，可是我沒有。：（嘗試用sephadax G15 進行了純化，出現了五個沒有分開的峰，第六個峰分的還算可以。考慮到可能是粗提物中的組分太多，于是對粗提物用sephadex G200進行了純化，得到一個單一峰，收集后，冷凍干燥，再過sephadex G50，得到兩個吸收峰，可是實驗發現，這兩個吸收峰沒有抑菌活性了：（洗脫液用的是pH7.0的PBS，檢測波長280nm。請問可能出現的問題有哪些？洗脫液選擇的有問題？檢測波長有問題？｛我的這種多肽，資料上說HPLC的檢測波長為210nm,也有205nm的。｝

你的問題很不明確,用sephadexLH-20純化除了有一部分凝膠過濾外,還有一些分配色譜的作用,所以這個介質和sephadax G15 是不太一樣的,你純化出多少峰都應該進行抑菌實驗,否則很難知道你要的組分在哪里.既然這個分子量這么小,那你上sephadex G200,估計你的目標多肽在最后面,所以你得到的那個峰不一定有你要的東西,而在后面,我是這樣猜測的,關鍵你要測定活性,所以你再純化也沒有活性,問題在于你沒有時時做活性檢測,填料選擇不很正確,檢測波長我不清楚對不對,關鍵你要選擇合適的柱子,同時每一步都做活性檢測.

我確實是對每個峰都作了抑菌實驗,Sephadex G15的每個峰都有抑菌活性.粗提物上G200只得到了一個吸收峰,要是我要的組分在后面,可它連個小峰都沒有呀.。此外，有人建議我，先使用硅膠柱對粗提物進行處理，請問可供選擇的柱子有哪些？謝謝。

那你沒有說明G200的峰是不是有活性，你也可以考慮硅膠填料，那得選擇c8或者c4 的反相硅膠的柱子，可以做HPLC，這樣也是不錯的選擇，畢竟通常的凝膠柱子很難有很好的分離效果。

66) 如果我用sephadex G-25脫鹽，如何選擇緩沖液？因為我認為，如果選擇含鹽的緩沖液，本身帶入了鹽，能起到脫鹽的效果嗎？如果選擇含鹽的緩沖液，
緩沖液里含有的鹽會最后流出來嗎？
另外，分子篩有沒有載量的問題？
緩沖液選擇看你需要什么緩沖液就選擇什么,沒有什么特別的要求.你的緩沖液當然是沒有鹽的,否則那何必除鹽呢.含鹽緩沖液當然不能去掉鹽了,它只能把你樣品中的鹽去除,用的原理是蛋白在柱子中走得比鹽要快,所以先出來.如果你緩沖液中有鹽那雖然鹽有后出的原理,但是因為你一直用含鹽的緩沖液去沖柱子,所以它的鹽是去不掉的,這和樣品中的鹽是不一樣的.
分子篩其實也有載量的問題,但是關鍵還是看上樣的體積,例如分離上樣體積不能大于10%柱床體積,脫鹽不能大于30%,具體的數和樣品有很大關系.

67) 既然這樣，我想完全脫鹽時，洗脫液可以選擇水嗎？因為緩沖液中的緩沖對總會有鹽的存在，對不對？
是的,只要你的樣品在水中溶解得很好,而且很穩定,那選擇水就可以.

68) 請教色譜兄，我現在用纖維素分離純化蛋白和peg-蛋白，跑完我用page檢測了一下，沒有完全分開，有一些是一起流出來的，我想知道為什么分離效果不好？我該如何調整阿？加長柱子可行嗎？還是要更換介質阿？我用的梯度洗脫。多謝拉！
peg-蛋白要想完全分開是比較困難的,因為PEG修飾的程度不一樣,所很難完全分開,不過纖維素分離的效果是要差點,你可以通過延長柱子,降低流速,延長梯度的辦法來提高分辨率,不行你可以換瓊脂糖系列的,但是我覺得你也可以考慮疏水,這兩個方法都可以.此外洗脫你也可以用不同鹽濃度階段洗脫,這樣有時候分離效果也不比梯度的差.

69) 非常感謝色譜兄，瓊脂糖的比纖維素的好很多嗎？另外，上次你給我了份材料沒有價格，能否給份有價格的材料，這樣也好和老板談談，因為老板控制的挺嚴，謝謝！！flyhyx@yahoo.com
有的，到時候發給你吧。瓊脂糖肯定比纖維素分離效果要好，載量也大，還有就是柱床體積不會變化，流速高。

70) 想請較：質粒純化中超螺旋和線性的如何實現有效分離（制備規模），且不使用plasmidselect之類親和介質。
親和是最有效的方法，我們有現成的工藝，包括去內毒素，你可以把你的郵件pM給我，我給你發一份相關的材料，你可以看看。

71) 我所純化的蛋白質大概是66kDalton，進行的親和純化。現在出現幾個問題想請教：
1。用的Ni-NTA進行親和純化，以前一直是在 250mM咪唑中洗下目標帶，現在50mM就有，是不是我的鎳柱不太好使。
2。因為親和純化后我的蛋白在最上面，所以我現在用sephadex G－100，但是我發現效果很差，不僅回收率低，而且也只有小分子量的雜帶能去掉。因為在我的目標帶下面不久就有一個小的雜帶，而且我想把我的蛋白去結晶，那樣要求的純度就很高。這樣的話是不是選用的純化材料不對，而且對于流速和柱子長度要求就很嚴格了。
有可能你的載量下降了，所以才那樣，你需要清洗了。
我覺得你最好選擇新的填料，其實你要是條件好的話，僅一步就可以純化到95%，我可以把我們的方法告訴你，你pM你的郵件給我就好了。

72) 1。我的蛋白bind在C4 column 上了，100％的ACN都沒辦法洗下來，異丙醇也試過了，還有什么好方法？
2。在跑RP-HPLC的時候，如果樣品的鹽濃度太高了，有影響么？
那實在不型可以考慮極性更低的乙酸乙酯等物質.此外洗不下來有沒有可能變性沉淀在柱子上下不來,你的100％的ACN里面有三氟乙酸嗎,我覺得出不來的原因有不少,不一定僅是洗脫的問題,所以用反相分離蛋白還是得很小心,此外不知道你的柱子是不是專門用于純化蛋白的,因為孔徑太小也不適合分離蛋白.

ACN 中含有1％的TFE。
有可能是蛋白變性，能用UREA or Guanidine hydrochloride 洗么？
不過在用isopropanol洗的時候，會有一些峰，但好像總是洗不干凈
column 是專門用來純化