液相色譜-質譜聯用系統用于小分子化合物分析時的幾點體會
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下一篇 2007-08-19 00:00:59/ 個人分類：液質聯用
審評十室 李志萬
液質聯用儀因其對大部分化合物的高靈敏度得到越來越廣泛的應用，適合于體內藥物、體內有毒物質、藥物的雜質等物質的定性和定量分析等領域。與傳統的色譜分離檢測器（紫外、熒光、視差、蒸發光散射、電化學等）檢測的分析手段比較，質譜屬于液相色譜的廣適性檢測器，具有明顯的優勢，該方法適用范圍更廣，靈敏度和高通量的特點，能夠滿足多個領域的定性和定量要求。
液質聯用儀用于小分子化合物定性已有多年歷史，普通高效液相系統只能對已知化合物（有標準品的化合物）通過峰位來定性，對于未知化合物卻無能為力。而高效液相色譜—質譜聯用儀可以對化合物作多級質譜，通過多級質譜的分析來推測化合物的結構，從而對已知和未知化合物均可以較準確的定性。
液質聯用儀還可用于小分子化合物定量，且與用普通高效液相系統對化合物進行定量相比，其不需要定量的化合物必須與樣品中的其它有類似性質的成分完全分離，而高效液相色譜—質譜聯用儀對化合物間的分離度沒有要求，不但對保留時間不一致的物質能區分開，即使保留時間完全一致也同樣互不干擾，只要過濾出想測的物質即可；且該方法可在數分鐘內對幾十個化合物同時定量，簡便、快捷、靈敏、可靠。
質譜儀的定量原理是在電壓和氣流的作用下把待測物加氫離子（正離子方式）或減氫離子（負離子方式）后帶電荷，儀器檢測到的是一定質核比（m/z）的物質，即選擇離子監測（SIM），其他質量數的物質能被濾掉，其他原理及要求同一般色譜要求。目前多使用的一般儀器是單位質量分辨，可將分子量相差1的物質完全可以區分，專屬性高，用單四級桿質譜儀就可以定量；有時為了進一步保證檢測的準確性，把待測物加能量打碎，產生碎片離子（子離子），對母離子和子離子同時進行檢測，采用三重四級桿質譜儀，也就是用選擇反應監測（SRM）定量，母離子和子離子均完全一樣的物質非常少見，因此定量的準確性更好，檢測限更低。
根據使用液質聯用儀的經驗和審評體會，認為在使用液質聯用儀測定和分析中需注意以下問題：
1) 測試者需根據自己的測試需要確定適宜的離子源。液質聯用的質譜儀是大氣壓下的電離，電離方式屬于軟電離，當增加能量時，脫掉的碎片為中性分子，對于電離穩定性差的物質（如苷類，小肽等）逐步增加能量會依次逐個脫掉糖或氨基酸，得到非常多的片斷信息，對于結構解析非常有好處，現有儀器最多可以做到11級質譜，該類質譜的缺點是至今還沒有統一的譜庫，不同的儀器碎片離子不很一致。以往常用的EI是一種強電離，一般得不到分子離子峰的信息，對于電離穩定的化合物有助于結構解析，FAB電離強度略弱，一般可以得到分子離子峰，碎片也較多，同時可以產生正負離子，EI和FAB的好處是電離方式穩定，有譜庫可查，對于已知化合物鑒定更有幫助，但這兩種質譜都沒有多級質譜，提供的碎片信息有限。
2) 一級圖譜測定和分析時，質量數范圍應充分放寬，一是為了防止漏掉可能的雜質，二是防止觀察不到多聚物。一般的質譜儀可以檢測到50-1500。這點對于評價化合物純度，以及選擇適宜的雜質檢測方法很有意義。
3) 多級圖譜定性測定時，首先要保證一級質譜的峰強度，待測物是最強峰，以保證碎片峰的準確性，一般正離子檢測達應達到e7（代表最強峰的強度，值越大，峰越強），負離子檢測達e6；一級質譜峰足夠強才能保證碎片峰的強度，否則將會導致碎片峰中雜峰過多，難于分辨哪一個碎片峰來源于樣品，為結構解析帶來難度。
4) 提供圖譜時信息盡可能詳盡，一般質譜儀測定時會給出詳細的相關信息，提供給對方時不要刪除，如：電離方式是正離子（+ESI，+APCI，+APPI）還是負離子（-ESI，-APCI，-APPI），檢測方式是一級質譜（MS）、選擇離子監測（SIM）、選擇反應監測（SRM）還是二級質譜全掃描（FULL MS2），峰強度等。這樣不僅方便進行資料的回顧性分析，也便于審評人員進行技術評價。
5) 用液質聯用儀進行定量時，在提供上述信息的同時，而且定量圖譜上盡可能標明峰面積和保留時間，要提供空白樣品和最低定量限樣品的圖譜，以保證可靠性。
6) 進行定量分析前，為保證檢測下限盡可能低，需要對化合物的儀器參數進行優化。優化時應注意使待測物母離子峰強度保持適宜的強度（一般在e6左右即可），過強或過弱均可能會使優化的參數不準確；其次應在總離子流穩定的情況下進行參數優化，一般要求波動小于10%。參數優化后可根據經驗再進行適當的調整，以保證更好的適用性。
7) 用液質聯用儀進行雜質分析時，最好有二極管陣列檢測器（DAD），提供紫外色譜圖、質譜色譜圖和相應峰位雜質的多級質譜圖。考慮到DAD一般多連接在質譜儀的前面，故質譜色譜圖應比紫外色譜圖的保留時間略長。
8) 由于質譜的穩定性沒有普通檢測器好，定量分析時最好有內標，內標與待測物最好性質相近，保留時間基本一致，待測物的氘代品為最佳選擇。測定基質復雜的生物樣品時，方法學確證要測定稀釋效應和基質效應，建立的方法要消除這兩種效應的干擾。
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TAG: lcms液質聯用定性
