問題：高精度數據，如
orbitrap，在進行SILAC標記定量實驗中，如用K4進行標記，會發現K4標記的肽段的鑒定數量要遠遠小于正常的肽段。
原因：回去查詢MS2圖譜，會發現，extract.msn這個腳本把K4對應的MS2圖譜的前體離子歸結到其第一同位素即K0對應的前體離子上，這樣，本來應該為K4標記的肽段，卻錯誤的認為是K0的肽段。
這個過程與搜庫本身沒有關系。K4標記的肽段的y系列離子雖然都是標記的，但是由于MS2是在離子阱內得到，本身的數據精度達不到，所以在搜庫是完全可以忽略由于標記帶來的質量差別。所以理論上對于K0或者K4對應的肽段的MS2圖譜可以認為是相同的，當然這是對于搜庫來說。也就是說搜庫的結果并不能區別K0與K4，那么是哪一步來確認是K0還是K4呢？
問題就出在extract.msn這一步上，即從raw文件提取MS2圖譜這一步上。
首先理一下orbitrap一個ms循環的過程，暫考慮動態排除：
1、在orbitrap中進行高精度的MS1掃描；按照強度對離子進行排序，比如1到10位；
3、比如排位第一的為m/z 500.143的離子，那么在LTQ里面就會在左側1.5，右側1.5這個window（具體數值可以設置）內進行母離子的isolation，然后進行CID碰撞斷裂，進而得到MS2圖譜；這個MS2的圖譜在raw文件中記錄為500.143@…………，在正常的鑒定中這個過程（上面第三步）一直循環；
4、若上面這個肽段有一個同位素標記的對應的肽段為502.143，也排在了前十位，那么也有機會進行MS2的
分析，這樣同樣可以得到一樣MS2圖譜，502.143@…………，
好了，數據已經產生了，本來，上面這兩張圖譜分別屬于兩個不同的母離子，但是extract.msn這個腳本卻自作聰明，認為502.143@…………這個圖譜是的母離子是500.143@…………的母離子的同位素峰，從而認為502.143@…………的最終的母離子也是500.143，因而生成的dta中的母離子信息由502.143被篡改了500.143；
至于extract.msn這個腳本為什么會這么認為無從考證，但是可以肯定的是，腳本在進行上面母離子歸結時很可能讀過該MS2圖譜對應的母離子window內的MS1圖譜，同時做了一定的同位素pattern分析，否則也不會做出這樣愚蠢的決定,另一種可能性是沒有考慮到同位素pattern,認為所有在設定范圍內的峰都是同位素峰。
上面說的第三步中應該沒有考慮同位素峰的問題，即沒有考慮第一同位素與第二同位素高低的關系，而僅僅是按照強度進行的排序。由鑒定結果看，大部分離子都是二價的，考慮到第二同位素問題，isolation window至少應該是前后0.5，前后1比較保險，但是考慮到LTQ的準確度，是前后1.5個m/z（系統默認前后1），從這個意義上講，雖然理論上上面兩個母離子是單獨進行分離并分析得到的MS2,實際上被分析的離子可能大部分是相同的，這也是兩個MS2圖譜幾乎相同的原因（除去上面說到的同位素本身對y系列離子的質量在LTQ上的影響較小）。
現在對整個過程應該比較清楚了。
母離子信息的唯一來源就是高精度的MS1圖譜，上面說過，extract.msn會分析MS2圖譜對應的母離子window內的MS1圖譜，比如分析502.143@…………這個MS2圖譜時一定分析過至少是包含510這個母離子在內的window的MS1圖譜的同位素pattern，遺憾的是，它沒有能夠準確地做出502.143是一個獨立的母離子的判斷。當然我們不得不承認這個識別的過程可能是比較復雜，要考慮到一個肽段的同位素峰的強度pattern，500.143這個肽段在502.143一定有一個同位素峰，但是這個強度一定不是現在這獨立的肽段的強度。若使用profile模式掃描，各個同位素峰的相對強度值會更準確，會有利于上面的這個識別過程。
說到這里，又看到了一個可能的后果，就是502.143這個位置不是在同位素標記定量實驗中的對應的重標肽段，而是在普通的鑒定實驗中的一個完全不相干的肽段，extract.msn仍然把他認為是500.143的同位素峰，而且其MS2的母離子仍然認為是500.143，這樣就會出現錯誤的結果。當然，若是存在這樣的情況，由于上面降到的isolation window的問題，兩個母離子對應的MS2可能也好不到哪里去，因為是兩種母離子的混合二級質譜圖，這樣的圖譜搜庫本身也是問題，即使分值合格也應該是錯誤的結果，那么這樣是不是也可以作為一個篩選的
標準呢？若能確認一個MS1后的兩個不相關的離子靠的很近（如2個m/z以內），且都被鑒定，這樣的結果的FPR應該很高。
說了這么多，其實最根本的問題還是同位素pattern識別問題，在以前進行的O18標記定量時就有人曾考慮過這個問題。相信隨著質譜精度的提高，以及算法的優化，這也不是個問題了。
當然出現這個問題并不會最終影響定量結果,如果你是用較好的軟件進行同位素標記定量的合適處理,只會在鑒定結果上給人假象。
2009-07-03 09:32
