蛋白質工程研究的核心內容

蛋白質結構分析
　　蛋白質工程的核心內容之一就是收集大量的蛋白質分子結構的信息，以便建立結構與功能之間關系的數據庫，為蛋白質結構與功能之間關系的理論研究奠定基礎。三維空間結構的測定是驗證蛋白質設計的假設即證明是新結構改變了原有生物功能的必需手段。晶體學的技術在確定蛋白質結構方面有了很大發展，但是最明顯的不足是需要分離出足夠量的純蛋白質（幾毫克～幾十毫克），制備出單晶體，然后再進行繁雜的數據收集、計算和分析。
另外，蛋白質的晶體狀態與自然狀態也不盡相同，在分析的時候要考慮到這個問題。核磁共振技術可以分析液態下的肽鏈結構，這種方法繞過了結晶、X－射線衍射成像分析等難點，直接分析自然狀態下的蛋白質的結構。現代核磁共振技術已經從一維發展到三維，在計算機的輔助下，可以有效地分析并直接模擬出蛋白質的空間結構、蛋白質與輔基和底物結合的情況以及酶催化的動態機理。從某種意義上講，核磁共振可以更有效地分析蛋白質的突變。國外有許多研究機構正在致力于研究蛋白質與核酸、酶抑制劑與蛋白質的結合情況，以開發
具有高度專一性的藥用蛋白質。

結構、功能的設計和預測
　　根據對天然蛋白質結構與功能分析建立起來的數據庫里的數據，可以預測一定氨基酸序列肽鏈空間結構和生物功能；反之也可以根據特定的生物功能，設計蛋白質的氨基酸序列和空間結構。通過基因重組等實驗可以直接考察分析結構與功能之間的關系；也可以通過分子動力學、分子熱力學等，根據能量最低、同一位置不能同時存在兩個原子等基本原則分析計算蛋白質分子的立體結構和生物功能。雖然這方面的工作尚在起步階段，但可預見將來能建立一套完整的理論來解釋結構與功能之間的關系，用以設計、預測蛋白質的結構和功能。

創造和改造
　　蛋白質的改造，從簡單的物理、化學法到復雜的基因重組等等有多種方法。物理、化學法：對蛋白質進行變性、復性處理，修飾蛋白質側鏈官能團，分割肽鏈，改變表面電荷分布促進蛋白質形成一定的立體構像等等；生物化學法：使用蛋白酶選擇性地分割蛋白質，利用轉糖苷酶、酯酶、酰酶等去除或連接不同化學基團，利用轉酰胺酶使蛋白質發生膠連等等。以上方法只能對相同或相似的基團或化學鍵發生作用，缺乏特異性，不能針對特定的部位起作用。采用基因重組技術或人工合成DNA，不但可以改造蛋白質而且可以實現從頭合成全新的蛋白質。
　　蛋白質是由不同氨基酸按一定順序通過肽鍵連接而成的肽構成的。氨基酸序列就是蛋白質的一級結構，它決定著蛋白質的空間結構和生物功能。而氨基酸序列是由合成蛋白質的基因的DNA序列決定的，改變DNA序列就可以改變蛋白質的氨基酸序列，實現蛋白質的可調控生物合成。在確定基因序列或氨基酸序列與蛋白質功能之間關系之前，宜采用隨機誘變，造成堿基對的缺失、插入或替代，這樣就可以將研究目標限定在一定的區域內，從而大大減少基因分析的長度。一旦目標DNA明確以后，就可以運用定位突變等技術來進行研究。
定位突變蛋白質中的氨基酸是由基因中的三聯密碼決定的，只要改變其中的一個或兩個就可以改變氨基酸。通常是改變某個位置的氨基酸，研究蛋白質結構、穩定性或催化特性。噬菌體M13的生活周期有二個階段，在噬菌體粒子中其基因組為單鏈，侵入宿主細胞以后，通過復制以雙鏈形式存在。將待研究的基因插入載體M13，制得單鏈模板，人工合成一段寡核苷酸（其中含一個或幾個非配對堿基）作為引物，合成相應的互補鏈，用T4連接酶連接成閉環雙鏈分子。經轉染大腸桿菌，雙鏈分子在胞內分別復制，因此就得到兩種類型的噬菌斑，含錯配堿基的就為突變型。再轉入合適的表達系統合成突變型蛋白質。
盒式突變1985年Wells提出的一種基因修飾技術——盒式突變，一次可以在一個位點上產生20種不同氨基酸的突變體，可以對蛋白質分子中重要氨基酸進行“飽和性”分析。利用定位突變在擬改造的氨基酸密碼兩側造成兩個原載體和基因上沒有的內切酶切點，用該內切酶消化基因，再用合成的發生不同變化的雙鏈DNA片段替代被消化的部分。這樣一次處理就可以得到多種突變型基因。
PCR技術DNA聚合酶鏈式反應是應用最廣泛的基因擴增技術。以研究基因為模板，用人工合成的寡核苷酸（含有一個或幾個非互補的堿基）為引物，直接進行基因擴增反應，就會產生突變型基因。分離出突變型基因后，在合適的表達系統中合成突變型蛋白質。這種方法直接、快速和高效。
高突變率技術從大量的野生型背景中篩選出突變型是一項耗時、費力的工作。有兩種新的突變方法具有較高的突變率：①硫代負鏈法：核苷酸間磷酸基的氧被硫替代后修飾物（α－（S）－dCTP）對某些內切酶有耐性，在有引物和（α－（S）－dCTP）存在下合成負鏈，然后用內切酶處理，結果僅在正鏈上產生“缺口”，用核苷酸外切酶III從3｀→5｀擴大缺口并超過負鏈上錯配的核苷酸，在聚合酶作用下修復正鏈，就可以得到二條鏈均為突變型的基因；②UMP正鏈法：大腸桿菌突變株RZ1032中缺少脲嘧啶糖苷酶和UTP酶，M13在這種宿主中可以用脲嘧啶（U）替代胸腺嘧啶（T）摻入模板而不被修飾。用這種含U的模板產生的突變雙鏈轉化正常大腸桿菌，結果含U的正鏈被寄主降解，而突變型負鏈保留并復制。
蛋白質融合將編碼一種蛋白質的部分基因移植到另一種蛋白質基因上或將不同蛋白質基因的片段組合在一起，經基因克隆和表達，產生出新的融合蛋白質。這種方法可以將不同蛋白質的特性集中在一種蛋白質上，顯著地改變蛋白質的特性。現在研究的較多的所謂“嵌合抗體”和“人緣化抗體”等，就是采用的這種方法。