原位雜交實驗原理與方法

一、目的

本實驗的目的是學會原位雜交的使用方法。了解各種原位雜交的基本原理和優缺點。

二、原理

原位雜交組化(簡稱原位雜交，in situ hybridization histochemistry;ISHH)屬于分子雜交的一種，是一種應用標記探針與組織細胞中的待測核酸雜交，再應用標記物相關的檢測系統，在核酸原有的位置將其顯示出來的一種檢測技術。原位雜交的本質就是在一定的溫度和離子濃度下，使具有特異序列的單鏈探針通過堿基互補規則與組織細胞內待測的核酸復性結合而使得組織細胞中的特異性核酸得到定位，并通過探針上所標記的檢測系統將其在核酸的原有位置上顯示出來。

當然雜交分子的形成并不要求兩條單鏈的堿基順序完全互補，所以不同來源的核酸單鏈只要彼此之間有一定程度的互補順序(即某種程度的同源性)就可以形成雜交雙鏈。

探針的種類按所帶標記物可分為同位素標記探針和非同位素標記探針兩大類。目前，大多數放射性標記法是通過酶促反應將標記的基因摻入DNA中，常用的同位素標記物有3H、35S、125I和32P。同位素標記物雖然有靈敏性高，背底較為清晰等優點，但是由于放射性同位素對人和環境均會造成傷害，近來有被非同位素取代的趨勢。非同位素標記物中目前最常用的有生物素、地高辛和熒光素三種。

探針的種類按核酸性質不同又可分為DNA探針、cDNA探針、cRNA探針和合成寡核苷酸探針。cDNA探針又可分為雙鏈cDNA探針和單鏈cDNA探針。

原位雜交又可分為菌落原位雜交和組織原位雜交。

菌落原位雜交(Colony in situ hybridization)　　菌落原位雜交是將細菌從培養平板轉移到硝酸纖維素濾膜上，然后將濾膜上的菌落裂菌以釋出DNA。將NDA烘干固定于膜上與32P標記的探針雜交，放射自顯影檢測菌落雜交信號，并與平板上的菌落對位。

組織原位雜交(Tissue in situ hybridization)　　組織原位雜交簡稱原位雜交，指組織或細胞的原位雜交，它與菌落的原位雜交不同。菌落原位雜交需裂解細菌釋出DNA，然后進行雜交。而原位雜交是經適當處理后，使細胞通透性增加，讓探針進入細胞內與DNA或RNA雜交。

(一)探針的選擇

根據不同的雜交實驗要求，應選擇不同的核酸探針。在大多數情況下，可以選擇克隆的DNA或cDNA雙鏈探針。但是在有些情況下，必須選用其它類型的探針如寡核苷酸探針和RNA探針。例如，在檢測靶序列上的單個堿基改變時應選用寡核苷酸探針，在檢測單鏈靶序列時應選用與其互補的DNA單鏈探針(通過克隆人M13噬菌體DNA獲得)或RNA探針，寡核苷酸探針也可。長的雙鏈DNA探針特異性較強，適宜檢測復雜的靶核苷酸序列和病原體 ，但不適宜于組織原位雜交，因為它不易透過細胞膜進入胞內或核內。在這種情況下，寡核苷酸探針和短的PCR標記探針(80～150bp)具有較大的優越性。

在選用探針時經常會受到可利用探針種類的限制。如在建立DNA文庫時，手頭沒有篩選特定基因的克隆探針，這時就可用寡核苷酸探針來代替。但必須首先純化該基因的編碼蛋白，并測定6個以上的末端氨基酸序列，通過反推的核苷酸序列合成一套寡核苷酸探針。如果已有其它動物的同種基因克隆，因為人類和動物間在同一基因的核苷酸順序上存在較高的同源性，因此可利用已鑒定的動物基因作探針來篩選人類基因克隆。對于基因核苷酸序列背景清楚而無法獲得克隆探針時，可采用PCR方法擴增某段基因序列，并克隆人合適的質粒載體中，即可得到自己的探針。這種方法十分簡便，無論基因組DNA探針還是cDNA探針都可以容易地獲得，而且，可以建立PCR的基因檢測方法，與探針雜交方法可作對比，可謂一舉兩得。

(二)探針的標記方法

在選擇探針類型的同時，還需要選擇標記方法。探針的標記方法很多，選擇什么標記方法主要視個人的習慣和可利用條件而定。但在選擇標記方法時，還應考慮實驗的要求，如靈敏度和顯示方法等。一般認為放射性探針比非放射性探針的靈敏度高。放射性探針的實際靈敏度不依賴于所采用的標記方法，如隨機引物延伸法往往得到比缺口平移法更高的比活性 。在檢測單拷貝基因序列時，應選用標記效率高、顯示靈敏的探針標記方法。在對靈敏要求不高時，可采用保存時間長的生物素探針技術和比較穩定的堿性磷酸酶顯示系統。

(三)探針的濃度

總的來說，隨探針濃度增加，雜交率也增加。另外，在較窄的范圍內，隨探針濃度增加，敏感性增加。依我們的經驗，要獲得較滿意的敏感性，膜雜交中32P標記探針與非放射性標記探針的用量分別為5～10 ng/ml和25～1000ng/ml，而原位雜交中，無論應用何種標記探針，其用量均為0.5～5.0μg/ml。探針的任何內在物理特性均不影響其使用濃度，但受不同類型標記物的固相支持物的非特異結合特性的影響。

(四)雜交率

在探針過量的條件下，雜交率主要依賴于探針長度(復雜度)和探針濃度。

(五)雜交最適溫度

雜交技術最重要的因素之一是選擇最適的雜交反應溫度。若反應溫度低于Tm 10～15℃，堿基順序高度同源的互補鏈可形成穩定的雙鏈，錯配對減少。若反應溫度再低(Tm-30℃)，雖然互補鏈之間也可形成穩定的雙鏈，但互補堿基配對減少，錯配對增多、氫鍵結合的更弱。如兩個同源性在50%左右或更低些的DNA，調整雜交溫度可使它們之間的雜交率變化10倍，因此在實驗前必須首先確定雜交溫度。通常有三種溫度可供試驗，即最適復性溫度、苛刻復性溫度及非苛刻復性溫度。溫度的選擇及溫度對雜交的影響見表18-3。最適復性溫度(Optimunm renaturation temperature, TOR)：Tor =Tm –25℃

苛刻復性溫度：Ts = Tm – (10或15℃)

非苛刻復性溫度：Tns =Tm – (30或35℃)

(六)雜交的嚴格性

影響雜交體穩定性的因素決定著雜交條件的嚴格性。一般認為在低于雜交體?(七)雜交反應時間

在條件都得到滿足的情況下，雜交的成敗就取決于保溫時間。時間短了，雜交反應不完成;時間長了也無益，會引起非特異結合增多。一般雜交反應要進行20h左右。1966年Britten和Kohne推薦用Cot =值來計算雜交反應時間。Cot 值實際上是雜交液中單鏈起始濃度(Co)和 反應時間(t)的乘積。實驗表明Cot =100時，雜交反應基本完成。Cot=0，基本上沒有 雜交。例如在液相雜交中 未標記的DNA 400μg/ml(按單股DNA每微克 紫外吸收值為0.024計算，總的吸收值為 9.6)，如果反應時間為21h，那么對于未標記的DNA來說，Cot =9.6/21 =100.8, 雜交完成了。對標記DN A(濃度為0.1μg/ml)來說Cot值為0.05，這就充分排除了標記DNA的自我復性。 Tm值25℃時雜交最佳，所以首先要根據公式(4)計算雜交體Tm 值。由此式可見，通過調節 鹽濃度、甲酰胺濃度和雜交溫度來控制所需的嚴格性。 (八)雜交促進劑

惰性多聚體可用來促進250個堿基以上的探針的雜交率。對單鏈探針可增加3倍，而對雙鏈探針、隨機剪切或隨機引物標記的探針可增加高達100倍。而短探針不需用促進劑，因其復雜度低和分子量小 ，短探針本身的雜交率就高 。

硫酸葡聚糖是一種廣泛用于較長雙鏈探針雜交的促進劑。這是一種多聚胺，平均分子量為500 000。另一種常見的促進劑是聚乙二醇(PEG)，PEG分子量小(6000～8000)、粘度低、價格低廉，但它不能完成取代硫酸葡聚糖。在某些條件下5%～10%硫酸葡聚糖效果較好，若用5%～10%PEG則可產生很高的本底。因此，使用促進劑時有必要優化條件。另一種多聚體促進劑是聚丙烯酸，用其鈉鹽，濃度為2%～4%。與硫酸葡聚糖相比，其優點是價格低廉，粘度低(MW=90 000)。

小分子化學試劑酚和硫氰酸胍也能促進雜交，它們可能是通過增加水的疏水性和降低雙鏈和單鏈DNA間的能量差異而發揮作用。酚作為雜交促進劑，只能在低DNA濃度的液相雜交中觀察到，該方法曾被稱為酚乳化復性技術，該法不能用于固相雜交，因酚可引起核酸與膜的非特異吸附作用，即使在液相雜交中的應用也是有限的。而硫氰酸胍可通過降低雙鏈DNA的Tm值而起作用。此外，該分子還可以促進RNA的雜交，有裂解細胞而抑制RNase的作用。總之，硫酸葡聚糖和聚乙二醇因能用于固相雜交是目前最常用的雜交促進劑。

(七)雜交反應時間

在條件都得到滿足的情況下，雜交的成敗就取決于保溫時間。時間短了，雜交反應不完成;時間長了也無益，會引起非特異結合增多。一般雜交反應要進行20h左右。1966年Britten和Kohne推薦用Cot =值來計算雜交反應時間。Cot 值實際上是雜交液中單鏈起始濃度(Co)和 反應時間(t)的乘積。實驗表明Cot =100時，雜交反應基本完成。Cot=0，基本上沒有雜交。例如在液相雜交中未標記的DNA 400μg/ml(按單股DNA每微克 紫外吸收值為0.024計算，總的吸收值為 9.6)，如果反應時間為21h，那么對于未標記的DNA來說，Cot =9.6/21 =100.8, 雜交完成了。對標記DN A(濃度為0.1μg/ml)來說Cot值為0.05，這就充分排除了標記DNA的自我復性。 Tm值25℃時雜交最佳，所以首先要根據公式(4)計算雜交體

Tm 值。由此式可見，通過調節 鹽濃度、甲酰胺濃度和雜交溫度來控制所需的嚴格性。

(八)雜交促進劑

惰性多聚體可用來促進250個堿基以上的探針的雜交率。對單鏈探針可增加3倍，而對雙鏈探針、隨機剪切或隨機引物標記的探針可增加高達100倍。而短探針不需用促進劑，因其復雜度低和分子量小 ，短探針本身的雜交率就高 。硫酸葡聚糖是一種廣泛用于較長雙鏈探針雜交的促進劑。這是一種多聚胺，平均分子量為500 000。另一種常見的促進劑是聚乙二醇(PEG)，PEG分子量小(6000～8000)、粘度低、價格低廉，但它不能完成取代硫酸葡聚糖。在某些條件下5%～10%硫酸葡聚糖效果較好，若用5%～10%PEG則可產生很高的本底。因此，使用促進劑時有必要優化條件。另一種多聚體促進劑是聚丙烯酸，用其鈉鹽，濃度為2%～4%。與硫酸葡聚糖相比，其優點是價格低廉，粘度低(MW=90 000)。小分子化學試劑酚和硫氰酸胍也能促進雜交，它們可能是通過增加水的疏水性和降低雙鏈和單鏈DNA間的能量差異而發揮作用。酚作為雜交促進劑，只能在低DNA濃度的液相雜交中觀察到，該方法曾被稱為酚乳化復性技術，該法不能用于固相雜交，因酚可引起核酸與膜的非特異吸附作用，即使在液相雜交中的應用也是有限的。而硫氰酸胍可通過降低雙鏈DNA的Tm值而起作用。此外，該分子還可以促進RNA的雜交，有裂解細胞而抑制RNase的作用。總之，硫酸葡聚糖和聚乙二醇因能用于固相雜交是目前最常用的雜交促進劑。

三、主要器材

醫用微波爐，恒溫水浴箱、濕盒、PNP筆等。

四、試劑

(二) 試劑:

● 2.5ml/L 的醋酸--2.5ml/L醋酸酐:

三乙醇胺 13.2ml

氯化鈉 5g

濃鹽酸 4ml

醋酸酐(用前加) 2.5ml;

● 20×SSC(pH7.0)：

氯化鈉 175.3g

枸櫞酸鈉 88.2g

雙蒸水定容至1L;

● 100×Denhardt‘s:

Ficoll 1g

PVP 1g

BSA 1g

ddH2O 定容至50ml;

● 雜交液：(50ml) 用量 終濃度

100%去離子甲酰胺 25ml 50%

100%葡聚糖硫酸脂 5mg 10%

100×Denhard‘s 0.5ml 1

1Mtris-HCL(PH8.0) 0.5ml 10Mm

5M NaCl 3ml 0.3M

0.5M EDTA (PH8.0) 0.1ml 1mM

10mg/ml 變性魚精DNA 0.5ml 100ug/ml

ddH2O定容至25ml

● 0.1M甘氨酸/PBS:

甘氨酸 7.5g

Na2HPO4 30.8g

NaH2PO4 2.8g

NaCl 8.5g

溶于800mlddH2O，定容至1000ml，高壓，室溫儲存;

●TSM1 (1000ml)：

1MTris-HCL(PH8.0) 100ml

5M NaCl 20ml

1M MgCl2 10ml

ddH2O定容至1000ml;

●TSM2 (1000ml)：

1MTris-HCL(PH8.0) 100ml

5M NaCl 20ml

1M MgCl2 50ml

ddH2O定容至1000ml;

● 抗體稀釋液： 100ml

BSA 1.0g

Tris X-100 0.4ml

疊氮鈉 0.4g

0.05M PBS (PH7.2)調至100ml;

● 0.05M PBS (PH7.2)：1000ml

Na2HPO4 15.4g

NaH2PO4 1.4g

NaCl 4.25g

●去內源性酶液(40ml)：

儲存液 用量 終濃度

10%甲醛 4.0ml 0.3—0.5%

冰醋酸 10.0ml 25.0%

加0.05MPBS至40ml

● 0.4% Triton-X 100

五、操作

(一) 脫蠟，水化：

1、 二甲苯10min 兩次

2、 無水乙醇3min 兩次

3、95%乙醇3min 一次

4、75%乙醇3min 一次

5、50%乙醇2min 一次

6、重蒸水2min 一次

7、PBS洗滌5min

(二) 將組織芯片放入去內源性酶液中浸泡30min;PBS洗滌5min

(三) 0.1M甘氨酸去游離醛基 15min;0.4%tritonX-100 洗10min;

(四) 用蛋白酶K與37℃孵育30min ，PBS振洗5min

(五) 在0.1mol/L三乙醇胺——0.25%乙酸酐中孵育10min ;在2×SSC中洗5min ;

(六) 滴加預雜交液42℃,30min;將RNA探針用預雜交液稀釋(1ng/uL~2ng/uL)

(七) 雜交

1、在載玻片表面覆蓋上雜交小室，加20~50uL的雜交液到組織芯片TMA上，42℃~44℃濕盒中過夜。

2、在4×SSC中37℃洗滌15min

3、2×SSC，加入RNA酶(大致為10ug/ml)37℃中洗滌30min，

4、0.5×SSC,37℃洗滌15min

(八)封閉

1、1%正常山羊血清孵育30min

2、用抗體稀釋液稀釋堿磷酶標記的抗地高辛抗體(1：500)37℃中孵育3h，PBS洗三次，每次5min

3、TSM1洗;

4、TSM2洗;

(九)顯色：用TSM2將NBT/BCIP按2：1稀釋進行顯色;顯微鏡下掌握染色程度

(十)終止顯色：用水終止

(十一)脫水，透明，封固

1、85%乙醇脫水，2min

2、95%乙醇脫水5min

3、無水乙醇脫水15min

4、二甲苯20min

5、封片，鏡檢