HPLC-MS法測定人血漿中米氮平濃度以及藥代動力學研究

作者:馮芳，田勇，張正行

摘要：目的：建立人血漿中米氮平濃度的HPLC—MS分析方法，用以測定健康受試者口服米氮平制劑后的血藥濃度，估算受試制劑和參比制劑的藥代動力學參數，評價兩種制劑的生物等效性和相對生物利用度。方法：血漿中加入內標地西泮后，環己烷提取，HPLC—MS分離、分析。色譜系統：Shimadzu ODS柱(150 toni x4.6 mm)，甲醇一醋酸銨溶液(0.01 mol/L )(75：25)為流動相，流速1.0 mL/min，柱溫30℃。質譜檢測方式：SIM。結果：米氮平的線性范圍為0.2—120 ng/ mL (r=0.9992)，最低檢測濃度達0.1 ng/mL，提取回收率≥85%。測定20名健康志愿者單劑量交叉口服試驗制劑與參比制劑后的血藥濃度經時過程，受試制劑和參比制劑的主要藥代動力學參數：Cmax(71.53±10.5)ng/mL 和(73.48±17.8)ng/mL;Tmax (2.0±0.8)h和(1.9±0.7)h;tl/2(22.33±2.05)h和(22.97±3.56)h，無顯著性差異;受試制劑的相對生物利用度為(101.3±16.2)%。結論：本法專屬、準確、靈敏。統計學結果表明受試制劑和參比制劑生物等效。

HPLC-M S Determination of Mirtazapine and Its

Pharmacokinetics and Bioequivalence in Human Plasma

FENG Fang，TIAN Yong，ZHANG Zheng—xing

Abstract ：Objective：An HPLC—MS method was established for the study of pharmaeokineties and bioequivalence of mirtazapine in human body.M ethod：Diazepam was used as internal standard.After adding diazepam，the plasma samples welt~extracted with eyelohexane and determined by HPLC—MS.The separation Was carried out on a Shimadzu VP—ODS column(150 mm x4.6 mm，packed with 5 Cl8 silica RP particle)at 30 oC.The mobile phase Was methanol一0.01 mol/L～am monium acetate(75：25).running at a flow rate of 1.0 mL/min.HPLC — MS Was performed in the selected ion monitoring(SIM)mode.A randomized crossover design Was performed in 20 healthy volunteers.In the two study periods，a single 30 mg dose of each capsule Was administered to each volun—teers.Result：The linear calibration CUl‘Ve was obtained in the concentration range of 0.2—120 ng/mL (r=0.9992).The detection limit of mirtazapine in plasma Was 0.1 ng/mL.The average recovery Was more than 85%.Cmax of mirtazapine in blood for the test and reference formulations are(71.53±10.5)ng/mL and (73.48±17.8)ng/mL at(2.0±0.8)h and(1.9±0.7)h respectively;tl/2(22.33±2.05)h and(22.97±3.56)h respectively.The relative bioavailability of the test formulation Was(101.3±16.2)%.Condusion：The assay Was proved to be sensitive.accurate and convenient.Th e two form. ulations were bioequivalent.

Key words：mirtazapine;HPLC—MS;plasma concentration;bioequivalenee

米氮平是一種新型抗抑郁藥，通過拮抗中樞自身及異體的腎上腺素 受體，增加去甲腎上腺素及5一羥色胺的釋放而產生抗抑郁作用，具有較好的耐受性，且幾乎無抗膽堿作用，治療劑量對心血管系統亦無影響。文獻報道的人血漿中米氮平的測定有高效液相色譜一熒光檢測法 、高效液相色譜一紫外檢測法 。這些方法或需特殊的色譜固定相或血漿樣品處理采用毒性較大的甲苯為提取溶劑，靈敏度低、分析時間長。高效液相色譜一離子阱檢測法雖具有較高的分析靈敏度，但采用SRM檢測方式和特殊的色譜柱，色譜峰形的對稱差，血漿樣品的處理過程煩瑣。考慮到臨床生物樣本量大、穩定性差、濃度低、專屬性要求高的特點，本文經試驗，首次建立了經簡單液一液相萃取后，測定人血漿中米氮平的HPLC— MS分離、分析方法，檢測方式：SIM。對該方法的評價結果顯示：方法的回收率高，分析時間短(3.5min/樣)，最低檢測濃度可達0.1 ng/mL，適用于米氮平藥物的臨床監控、藥代動力學和生物利用度、生物等效性研究。

1 實驗方法

1.1 儀器：HPLC—MS聯用系統：Waters Alliance2690一Micro Quattro Micro MSD聯用系統：含四元高壓泵、在線真空脫氣機、恒溫自動進樣器、柱溫箱、電噴霧離子化接口。Masslynx V3.5數據處理系統。

1.2 藥品與試劑：米氮平片為國內某公司研制(批號：030201，規格：15 mg每片)，對照片為歐加農(荷蘭)公司生產(批號：575365/587545，規格：30 mg每片)。米氮平對照品、地西泮對照品由某公司提供，純度1>99% 。甲醇為色譜純(Tedia公司，美國)，環己烷和醋酸銨均為分析純(南京化學試劑廠)，水為純凈水。

1.3 分析條件

1.3.1 色譜條件：色譜柱：Shimadzu VP—ODS(150 mln×4.6 mln，5 );Phenomenex預柱ODS(4

mm×3 mm);流動相：甲醇一醋酸銨水溶液(0.01mol/L )(75：25);流速：1.0 mL/min;柱溫：30℃ 。

1.3.2 質譜檢測參數離子極性：正離子;離子化方式：電噴霧離子化;檢測方式：選擇性離子檢測(SIM)，米氮平：m/z266.5[M+H] ，地西泮：m/z285.5[M+H] ;傳輸電壓：50 V;干燥氣流速：300L·h～;裂解氣溫度：350℃ ;毛細管電壓：3.56 kV。

1.4 樣品制備

1.4.1 標準溶液的配制：精密稱取米氮平對照品適量，甲醇溶解，制得濃度為100/mL 的貯備液，陰涼處保存。臨用前以流動相稀釋成各種濃度的米氮平對照品溶液。

精密稱取地西泮對照品適量，甲醇溶解并稀釋定容，制得濃度為100μg/mL 的貯備液，陰涼處保存。臨用前以流動相稀釋，制成濃度約1μg/mL 地西泮標準溶液。

1.4.2 血漿樣品的處理：經試驗，確定血漿樣品處理過程如下：血樣置試管(肝素化處理)中，立即于一3O℃冷凍保存。測定時，精密吸取血漿0.5 mL置于10 mL具塞離心管中，精密加入內標標準溶液15 L，混合均勻后，加入0.5 mol/L NaOH溶液100 L，漩渦10 S，加環己烷3.0 mL，渦旋提取3min，臺式離心機4000 r/min 離心10 min，分取環己烷層2.5 mL，45℃水浴中氮氣吹干。殘留物以150 L流動相溶解，高速離心10 rain后，取上清液20 L HPLC—MS分析，測定m/z 266.5(米氮平，[M+H] )，m/z285.5(地西泮，[M+H] )的峰面積。

1.5 藥代動力學和生物等效性研究

1.5.1 受試者選擇20名健康男性志愿受試者，年齡為19—25歲，體重5O一75 kg，身高164—189cm。常規體檢及生化檢驗結果證明：血、尿常規、肝、腎功能、心電圖均無異常，乙肝表面抗原檢查為陰性(表6)。受試前2周及試驗期間停止服用任何藥物，試驗期間忌煙、酒，統一飲食。受試前對試驗目的與要求完全了解，并由志愿者簽署知情同意書。試驗經南京軍區總醫院國家藥品臨床研究基地倫理道德委員會同意后進行。

1.5.2 試驗方案

采用雙周期兩制劑交叉試驗設計。20名男性健康受試者隨機分為A、B兩組，第一周期分別口服受試制劑和參比制劑，試驗結束后，間隔14天清洗期，再相互交叉進行第二周期試驗。受試者于試驗前兩周和試驗期間均不飲用酒類和咖啡類飲料，試驗前禁食過夜約12 h，次日晨(7：o0)空腹服用試驗制劑(30 ms/2片)或參比制劑(3Oms/片)，200 mL溫開水送服。受試者于服藥后4 h進統一餐。受試者于服藥前及服藥后0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3，4，6，10，24，48，72，96和120 h，分別采血4.0 mL于肝素抗凝試管中，3500 r/min 離心15 min，分離出血漿，一3O℃冷凍保存、待測。

1.5.3 臨床觀察內容

試驗工作在一期臨床觀察室中進行，受試者由臨床醫生監護，受試期間發生任何不良反應均及時處理和記錄。

2 結果

2.1 方法的專屬性：在上述色譜條件下，米氮平和地西泮峰形良好，米氮平和地西泮的保留時間分別為3.1 min和2.8 min(圖1)，血漿中雜質不干擾樣品測定。

2.2 線性關系及靈敏度：取離心管數支，于0.5 mL空白血漿中精密加入不同量的米氮平標準溶液，配成濃度為0.2，0.6，2.0，10.0，20.0，40.0，80.0，120.0 ng/mL 的標準血漿，按“血漿樣品的處理”項下操作，記錄峰面積。以樣品面積與內標面積(A/s)的比值對濃度(C)作直線回歸。得回歸方程：f=0.0176 C+0.0006 r t>0.9992顯然，在0.2—120.0 ng/mL 范圍內，質譜響應值和濃度線性關系良好。米氮平在血漿中的最低檢測濃度為0.1 ng/mL。

2.3 回收率試驗

對照樣品：取離心管數支，不加血漿，精密加人不同量的米氮平對照品溶液，使其濃度分別為2.0，20，80 ng/mL，并加人1 /mL 的內標溶液15L，混合后將溶劑揮干，殘渣用150μL流動相渦旋溶解，20μl 進人HPLC—MS分析。記錄色譜圖，并計算米氮平峰面積與內標峰面積的比值。回收率樣品：于離心管中加人0.5 mL空白血漿，精密加人不同量的米氮平對照品溶液，使其濃度分別為2.0，20，80 ng/mL，混合均勻后，加人0.5mol/L NaOH溶液100μL，漩渦10 s，加環己烷3.0 mL，渦旋提取3 min，于4000 r/min 離心10min，取上清液2 mL轉移至另一離心管中，加人1μg·mL 的內標溶液15 L，混合后在40℃水浴上用氮氣流吹干，殘渣用150 流動相渦旋溶解，20μl進入HPLC—MS分析。計算米氮平峰面積與內標峰面積的比值。

2.4 精密度試驗：取離心管數支，精密加人0.5mL空白血漿后，再精密加人不同量的米氮平對照品溶液，配成濃度為2.0，20，80 ng/mL 的含藥血漿，按“血漿樣品的處理”項下操作，記錄樣品面積與內標面積(A/s)的比值。測定日內精密度和5天內的日間精密度。

2.5 藥代動力學研究 ：受試制劑和參比制劑給藥后的血藥濃度一時間曲線見圖2，按“1.6”部分內容估算的主要藥代動力學參數見表3。供試片的相對生物利用度為(101.3±16.2)% 。

3 討論

3.1 由于人體血漿中米氮平的濃度較低，且存在著較大的個體差異，采用HPLC—UV法測定時，有時可觀察到少量雜質干擾其低濃度測定，有時則無法檢測到樣品。為保證臨床大量、且復雜生物樣本分析的專屬性和準確性，鑒于HPLC—MS法靈敏度高、具有二次分離作用的優勢，本文研究并建立了米氮平人血漿樣本高效液相色譜/質譜聯用分析方法，該方法對目標化合物及其內標同時進行選擇性離子檢測(m/z266.5及m/z285.5)，空白血漿無雜質干擾，最低檢測濃度可達0.1 ng·mL～，完全滿足臨床血藥濃度監測的要求。

3.2 在電噴霧離子化狀態下，用掃描方式測定米氮平的質譜，結果表明：[M+H] 離子(m/z 266.5)的響應明顯高于碎片離子，因此m/z 266.5離子被選擇作為米氮平的檢測離子。同樣的測定還表明：[M+H] 離子(m/z 285.5)為地西泮檢測離子最佳離子。進一步優化質譜條件，分別在傳輸電壓30，40，50，60 V，干燥氣流速200，300，350，400 L/h，裂解氣溫度250，300，320，350℃條件下考察米氮平[M+H] 離子(m/z 266.5)的響應，結果表明：傳輸電壓50 V、干燥氣流速300 L/h、裂解氣溫度350℃的條件下，米氮平準分子離子響應最大。

3.3 米氮平分子結構中含多個苯環，且含有多個氮原子，故在C18柱上有較長保留，易形成拖尾峰。本文嘗試采用甲醇一醋酸銨水溶液(0.01 tool/L )(75：25)、甲醇一水(含0.5%醋酸，0.5% 三乙胺)(75：25)等體系為流動相，發現甲醇一醋酸銨水溶液(0.01 tool·L )(75：25)體系產生分離效果最佳。在所選的色譜條件下，地西泮因峰形對稱，保留時間適宜，且血漿中無雜質干擾，而被用作分析測試的內標。

參考文獻

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