LC-MS法測定Beagle犬血漿中煙酸濃度及體內藥動學研究

作者:袁京群，吳筱丹，李士敏，樓健

摘要： 目的：建立測定Beagle犬血漿中煙酸的液相色譜一質譜聯用法。方法：色譜柱為Agilent Zorbax SB—Cl8(150mm×2.1mm，5μ m);以甲醇和0.05% 甲酸水溶液為流動相，進行梯度洗脫;流速0.2 mL/min;柱溫25℃ ;質譜條件為電噴霧電離源(ESI)，以選擇性正離子方式檢測，煙酸和內標甲硝唑的選擇檢測離子分別為m/z 124.10([M+H] )、m/z 172.20([M+H] )。并用健康Beagle犬6只，單劑量給予煙酸片1000 mg/只，進行了血藥濃度的測定。結果：煙酸血漿線性范圍為0.2003～250.4 μg/mL，檢測限為50.08 ng/mL，定量限為0.2003 μg/mL，方法回收率均大于95% 。結論：本方法專屬性強，靈敏度高，線性關系良好，操作簡便，適用于藥代動力學研究。

LC -M S Studies on Determination of Nicotinic Acid in Beagle Dog Plasma and Its Pharmacokinetics

YUAN Jing—qun。WU Xiao—dan，LI Shi—min，L0U Jian

(1.College of Pharmaceutical Science，Zhejiang University，Hangzhou 310031;

2.Center of Analysis and Measurement of Zhejiang University，Hangzhou，3 10029)

Abstract: 0bjective：To develop a sensitive and specific LC/MS method for determination of nicotinic acid in Beagle dog plasma.Methods：The LC/MS method was performed with Agilent Zorbax Eclipse SB—C 18(2.1 mm×150mm，5μm).The mobile phase consisted of CH3OH and 0.05%HCOOH，and gradient elution was adopted.Analysis were run at flow rate of0.2 mL/min.The temperature of column was 25℃.AP—ES1 was applied and 0pcrated in positive mode.The ion of monitor：m/z 124.10(nicotinic acid)，m/z 172.20(metronidazole，internal standard).Blood samples were obtained after a single dose of 1000 mg total nicotinic acid tablets.Results：The linear calibration curve was observed in the concentration range of 0.2003—250.4 g/mL。.The LOD and LOQ were 50.08 ng/mL and 0.2003 g/mL ，respectively.11he relative recoveries were more than 95% ，and the inter-and intraday-precision(RSD)was below 8.0% .Conclusion：The method was proved to be convenient，sensitive and rapid，and suitable for pharmacokinetic study of nicotinic acid in Beagle dogs.

Key words：LC/MS;nicotinic acid;plasma drug concentration;pharmacokinetics

煙酸為B族維生素之一，在體內能迅速轉化為煙酰胺。然后成為輔酶I和輔酶Ⅱ的組成部分。臨床上低劑量的煙酸主要應用于預防和治療因缺乏煙酸而引起的糙皮病，給藥劑量為每次50—300 mg，每日3—4次。據文獻報道，大劑量時可用于降血脂，但應用劑量的報道不一致，給藥劑量為每次1500 mg，每日劑量可達3—9 g。有關血漿中煙酸的測定方法主要是采用離子對高效液相色譜法 ，未見有高效液相色譜一質譜聯用方法的相關報道。

本實驗建立高效液相色譜一質譜聯用的方法測定血漿中煙酸的藥物濃度，旨在為l臨床進行藥動學和生物等效性研究提供測定方法。

1 儀器與試藥：Agilent 1 IOOLC/MSD SL型高效液相色譜一質譜聯用儀(含Agilent 1100二元輸液泵，電噴霧離子化接口的四極桿質譜檢測器及自動進樣器等);XW一80A旋渦混合器(上海醫科大學儀器廠);離心機(SORVALL Biofuge stratos)。煙酸對照品，由浙江海正藥業提供;煙酸片，每片100 mg(南京白敬宇制藥廠，批號：030702)。甲醇為色譜純(德國Merck公司)，其余試劑均為分析純，水為市售娃哈哈純凈水。

2 色譜條件及質譜條件

色譜條件：采用Agilent Zorbax SB—Cl8(2.1mm×150 mm，5μm )色譜柱，DiamonsilC18保護柱;流動相為甲醇和0.05% 甲酸水溶液，梯度洗脫：0～15min，甲醇從4%至95% ;流速0.2 mL/min;柱溫25℃ 。

質譜條件：AP—ESI正離子模式，干燥氣流速l3 L/min，干燥氣溫度350℃ ，霧化氣壓力207

kPa，毛細管電壓4000 V，碎片電壓100 V，選擇性離子檢測(SIM)：煙酸m/z 124.10[M+H] ，甲硝唑m/z 172.20[M+H] 。

3 血漿樣品處理方法

取血漿100μL，加內標甲硝唑溶液(1.006 mg/mL )10μL，旋渦振蕩30 S，加入甲醇一0.05%甲酸水溶液(80：20)的混合溶液900μL，旋渦振蕩30 S，離心(20000 r/min )30min，取上清液，微孔濾膜(0.45 μm)過濾后取5μ 進HPLC—MS分析。

4 方法專屬性

在本色譜條件下，對空白血漿加入對照品和內標、空白血漿和Beagle犬服藥后血漿加內標的色譜圖進行比較。煙酸的保留時間為3.070 min，甲硝唑的保留時間為9.522 min，血漿內源性物質及其他雜質基本不干擾樣品的分離測定，色譜圖如圖1一A、B、C所示。對照品質譜圖見圖2一A，內標甲硝唑質譜圖見圖2一B。

5 標準曲線制備及檢測限

取Beagle犬空白血漿9OμL，精密加入不同濃度的煙酸標準液10μL，使血漿煙酸濃度分別為0.2003，0.5008，1.002，2.003，5.008，10.02，50.08。100.2，200.3，250.4μ g/mL，按樣品預處理方法進行處理后進樣分析，以煙酸濃度為橫坐標，煙酸和內標峰面積比值為縱坐標，做線性回歸，得回歸方程為：Y=0.0101C+0.0009，r=0.9996，濃度(0.2003～10.02μg/mL );Y=0.0094C+0.0245，r=0.9995，濃度(5.008～250.4 μg/mL )。結果表明血漿中煙酸在0.2003～250.4 μg/mL 濃度范圍內有良好的線性關系。最低檢測限為50.08 ng/mL。

6 回收率及精密度試驗

取空白血漿，配制煙酸血漿濃度分別為0.2003，5.008，50.08，200.3μg/mL 的血樣數份，按前述樣品處理方法進行處理，取5 進HPLC—MS分析，以隨行的標準曲線計算方法回收率。日內平行做5次;隔日做5次。分別計算日內、日間差異及回收率。結果見表1。

7 穩定性試驗

取低、中、高4個濃度的質控樣品(血漿濃度分別為0.2003，5.008，5O.08，200.3μg/mL )，冷藏于一20℃環境中，分別于0，1，2，3，7，14 d測定各濃度血漿樣品的濃度，結果低、中、高4個濃度質控樣品測定的RSD分別為3.31% ，3.14% ，2.54% ，3.22% 。說明血漿樣品在一20℃冷藏14 d是穩定的。

8 Beagle犬血漿樣品的測定

健康Beagle犬6只，體重8—9 kg，購于浙江中醫學院Beagle犬生產基地，預飼養2周，單籠飼養，供給充分的水和食物。在服藥前禁食12 h，次晨空腹口服相應藥物，服藥后不吃食物，2 h后自由飲水。每組服藥前取空白血，單劑量給予煙酸片(1O片，相當于煙酸1000 mg)，在給藥后5，1O，2O，3O，45 min及1，1.5，2，2.5，3，4，5，6，7，8 h自犬后肢取靜脈血2.0 mL。血樣用肝素抗凝，3000 r/min 離心15 min分離血漿，于一20℃保存備用。血漿樣品照“3”項下操作，取5μL進HPLC—MS分析，以隨行的標準曲線計算含量。平均血藥濃度一時間曲線見圖3。其血藥濃度一時間數據用DAS ver1.O(Drug and Statistic for Windows)軟件計算，主要藥動學參數如表2所示。

9 討論

有關血漿中煙酸的測定方法國內外主要是采用離子對高效液相色譜法 。本實驗采用高效液相色譜一質譜聯用測定血漿中煙酸藥物濃度的方法，選用ESI源選擇性檢測(SIM)煙酸和內標124.1及172.2準分子離子，具有較高的靈敏度和專屬性;高效液相色譜一質譜聯用具有色譜分離與質譜分離的雙重功能，可以依靠質譜的分辨能力區分不同物質的色譜峰，抗干擾能力強，同時本實驗采用梯度洗脫的方法使血漿中其他干擾物的出峰提前，從而縮短了樣品的分析時間，可以滿足本實驗低濃度藥物測定及藥動學、生物利用度研究的需要。

參考文獻

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