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  • 瓊脂糖凝膠電泳技術

    上一篇 / 下一篇  2008-08-30 11:34:59/ 個人分類:實驗技術

    電泳基本原理

    遷移率(或泳動度)是指帶電顆粒在單位電場強度下泳動的速度,可用下列公式計算:

    U =υ/E =(d/t)/(V/l) =dl/Vt

    U為遷移率(cm2?V-1?min-1);υ為顆粒泳動速度(cm?s-1);E 為電場強度( V?cm-1);d為顆粒泳動的距離(cm);l為濾紙有效長度(cm);V為實際電壓(V);t為通電時間(s或min)。通過測量d, l, V, t, 即可計算出被分離物質的遷移率。

    1遷移率單位= 10-5 cm2?V-1?min-1在確定的條件下,某物質的遷移率為常數,是該物質的化學特征常數。 顆粒帶凈電荷多,直徑小而接近于球形,則在電場中泳動速度快,反之則泳動速度慢。

    遷移率還與分子的形狀,介質粘度,顆粒所帶電荷有關,遷移率與顆表面電荷成正比,與介質粘度及顆粒半徑成反比。

    影響瓊脂糖電泳遷移的主要因素

    電場強度 溶液的pH值 溶液的離子強度 電滲現象 溫度的影響 支持物的影響

    按分離原理分類:

    1.區帶電泳 2.移界電泳 3.等速電泳 4.聚焦電泳

    按有無固體支持物分類

    1. 紙上電泳 2. 醋酸纖維素膜電泳 3. 薄層電泳

    4. 非凝膠性支持物區帶電泳(支持物有:淀粉、纖維素粉、玻璃粉、硅膠)

    5. 凝膠支持區帶電泳(淀粉凝膠、聚丙稀酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠)

    影響瓊脂糖電泳遷移的主要因素

    DNA的大小 DNA的構象 瓊脂糖濃度 緩沖液 不同構像質粒

    緩沖液 TAE:乙酸鹽緩沖液 TBE:硼酸鹽緩沖液 TPE:磷酸鹽緩沖液

    實驗操作

    1. 用膠帶將洗凈、干燥的水平板的邊緣封住,形成一個膠模并水平放置。

    2. 按水平板的長×寬×0.5cm膠厚,量取0.5×TBE,并按0.7%的濃度稱取agarose瓊脂糖,在微波爐或電爐上加熱至全熔(清澈透明)。

    3. 等凝膠溫度降至大約50-60以下時,加入1 mg/L溴化乙錠(EB)至終濃度為0.5ug/mL ;搖勻并輕快地倒入水平板中,除掉氣泡,插入梳子。

    4. 凝固后,將梳子輕輕拔出。

    5.去掉膠帶,將水平板放入加有0.5×TBE電泳緩沖液的電泳槽中,并且使電泳緩沖液高出凝膠約1mm。

    6.在parafilm膜上依次加: ddH2O 6ul,上樣Buffer 2ul ,DNA 4ul 分別混勻后點樣,記錄點樣次序。

    7. 在水平板兩邊的點樣孔中分別加入6 μ l的λΔΝΑ/EcoRI+HindIII marker。

    8. 蓋好電泳槽蓋子,選擇適當的電泳電壓(≤5V/cm)及電泳方向(DNA陰極陽極),開始電泳。

    9. 當色素接近膠的先端,停止電泳,樣品在紫外燈下觀察、成像℃


    TAG: 凝膠電泳瓊脂糖

     

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