實戰：食品中殘留有機物定量分析中的那些“坑”

前一篇博文《食品中殘留物定性首選色譜-質譜聯用技術》介紹了應用色譜-質譜聯用技術對食品中殘留有機化合物的定性分析。本文同前一篇博文一樣，以歐盟指令和國家標準規定為依據，結合實際檢測工作，就色譜及色譜-質譜定量時應注意的一些問題和體會做一交流。

按照前文介紹的色譜-質譜檢測方法已對食品中某殘留被測物定性無誤了，接下來還要對檢出物進行定量分析。目前根據歐盟指令，將殘留物分為禁用物質和限用物質。禁用物質執行最低要求執行限（Minimum Required Performance Limits，MRPL），如：《農業部公告禁用獸藥目錄》等標準和法規。對于這類物質基本上是以檢驗標準方法檢出限作為是否檢出的判定依據。限用物質執行最大殘留限量（Maximum Residue Limits，MRL），如：《GB 2760—2014，食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》、《GB 2762-2012 食品安全國家標準 食品中污染物限量》、《GB 2763—2016，食品中農藥殘留最大限量》等標準和法規中都不僅規定了要檢測的物質，還規定了被測物的檢出限（MRL）。被測物最終結果檢出的值超過標準規定的MRL值將視為檢出，即為陽性結果。因此，被測物準確定性后的準確定量在最終出具的檢測報告中同等重要。

在《執行關于96/23/EC指令分析方法程序和結果解釋的歐盟委員會2002/657/EC指令》、《食品和飼料中農藥殘留分析質量控制和驗證程序SANCO/12571/ 2013指令》兩個指令及《GB/T 27404—2008，實驗室質量控制規范 食品理化部分》國家標準中，對殘留檢測方法的檢出限、準確度、精密度、回收率等分析學指標做了詳細規定。根據這些規定并結合實際工作就定量時應注意的事項歸納如下：

1.      標準物質。

根據《食安法》第五十七條規定：“食品檢驗機構按照國家有關認證認可的規定取得資質認定后，方可從事食品檢驗活動。”在實驗室認證認可評審中標準物質（過去實驗室稱為標準品）是重要考察因素之一，它直接關系到最終定量檢測結果是否準確。所以，實驗室管理手冊都會有專門一節描述對標準品的管理和使用。

認證認可實驗室采用的殘留分析用的標準物質均為有證標準物質（Certified reference material, CRM），產品應附有企業通過的質量認證證書、已知純度、產品檢測報告、不確定度、有效期證書和產品說明書等。實驗室應建立標準品目錄，記錄接收日期登記、驗收記錄和使用記錄等。要按照所附產品說明書的保存條件存放標準品，絕大部分標準品都要求低溫下儲存，最好存放在冰箱里，避光和防潮，最大限度地減少降解率。很多標準品在前述條件下可以儲存較長時間，大于供應商的有效期。在國外，通常用新有證標準物質對其純度進行檢驗后若沒有變化是可以繼續進行使用的，只要有完整的測試報告和記錄。但若某一被測目標物檢出需要精確定量時最好用新標準品。不過在國內實驗室認證評審時，有些評審員只接受帶原廠證的標準品，而不接受實驗室自己檢測驗證過的標準品。所以在國內實驗室認證前最好還是換新的標準品吧，避免不必要的麻煩。雖然這樣做造成了浪費和污染。

配制標準（包括內標標準）儲備液稱量標準品時一般采用萬分之一天平稱量，稱取量不少于10mg。儲備液容器標簽要標明品名、濃度、溶劑、配制日期和配制人并在有效期內保存于低溫避光容器內，還應該防止溶劑損失和防潮。有一種專門用于存放標準儲備液的雙磨口儲液瓶（見圖1.），價格比較貴，但重要的標準儲備液可以考慮選用。通常根據分析方法選擇溶解、定容溶劑。在建立新方法時，要根據被測物和檢測儀器特性合理選擇溶解、定容溶劑。工作液系列的配制要根據限量要求和方法學規定確定，容器標簽同樣必須標明名稱、濃度、溶劑、配制日期和配制人并在有效期內保存于低溫避光容器內，還應該防止溶劑損失和防潮。

              

圖1. 存放標準儲備液雙磨口儲液瓶

2.      有證標準樣品

有證標準樣品是指特定樣品中分析物被賦值，例如：雞肉中的氯霉素。由于有證標準樣品被視為是特定樣品中特定分析物的定值，所以它主要用做日常檢驗的質控樣品。與標準品添加到樣品中做回收相比，采用標準樣品是對分析方法全過程進行驗證，而標準品添加回收實際上沒有驗證提取效率這一步。因此，考核一個新檢測方法設計的是否合理，特別是提取效率是否滿足檢測要求，最好選用有證標準樣品。有證標準樣品通常是由國家計量部門或由國家計量部門批準、頒布并授權生產。購買時一定要仔細查看證書的有效性。有證標準樣品雖然是最理想的質控樣品，但是目前能提供的品種還比較少，日常檢測質控更多的還是采用標準品添加回收。

3.      定量方法

（1）         內標法。定量首選方法。若是色譜分析內標物可以考慮選擇同系物，若是色譜-質譜分析則首先考慮選擇與被測物化學結構相同的穩定同位素做內標物。內標物應在分析實驗的第一步（一般是提取）就加進去，這樣可以校正整個分析過程（除提取誤差外）所產生的系統誤差。有兩個小建議供參考：其一，對于多殘留分析需要選擇多個內標法（對于殘留獸藥最好是一對一），用一個內標物校正所有被測物質往往不如用外標法定量更準。其二，對于檢測的被測物絕對回收率低于方法學規定的回收率要求，但回收率較穩定，可以采用內標法用相對回收率將其回收率提高到方法學規定要求范圍內。而且內標法可以提高殘留分析方法的重現性，在沒有內標的情況下，重現性RSD常常會高于20%；而當使用內標時，RSD能降低到5%左右。在用液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）檢測時常常由于基質效應，回收率有時會較低，用內標法可以校正達到方法學要求。雖然良好的實驗室規范（GLP）認為衡量一個方法的是否可用應該用絕對回收率，但是，隨著檢驗工作量的增加，隨著儀器性能的提高，日常檢測用相對回收率完全可用滿足檢測需求，同時提高了工作效率，降低了工作強度。

（2）      外標法。采用外標法定量，通常要做定量校準曲線。殘留分析建立的曲線至少應有5點（在接近方法檢出限時可以包括零點）。其中，校準液系列的最低點濃度應為最低校正水平（LVL），該點通常與分析方法的最低檢出限相當，或者為低于相應報告限（RL）的濃度水平。RL不能低于最低定量限（LOQ）。在應用標準曲線定量時需關注這幾個問題：

（i）         檢測的被測物含量必須在定量曲線范圍內，接近方法檢出限曲線的濃度范圍至少覆蓋一個數量級。

（ii）       應描述曲線的計算公式，曲線數據擬合度應滿足指令和標準要求。

（iii）     應考慮曲線參數的適用范圍。例如，采用LC-MS/MS檢測時往往會有基質效應，所以，當以某一種基質液配置的定量標準曲線可能不適用另一種基質的定量，如：牛肉基質的氯霉素標準曲線，可能不適用蝦中氯霉素的定量。如圖2. 所示，由于基質效應的影響，在相同的響應值時，標準液與實際樣品的含量可能是不同的。不同基質的樣品響應值也會存在差異。B含量可以比A（標準品）高，也可以比A低。

              

圖2. 由于基質效應的影響，在相同響應值時標準液與實際樣品的含量可能不同

（3）      標準曲線添加法。有些被檢測的有機污染物在食品中普遍存在，如烘焙食品中的丙酰胺，很難找到空白樣品，這時樣品中殘留物的定量通常采用標準添加法。另外，現在認可實驗室都要參加相關的實驗室比對實驗或盲樣測試，一般僅提供測試樣品，并不提供對應的空白基質樣品。這時要得到比較好的定量數據可以考慮采用標準曲線添加法。

4.      補充幾個與定量分析相關的問題

（1）      要得到食品中殘留有機物定量分析的準確數據，實驗室應有運轉正常的質量保證體系，確保分析過程的每一步都有相應的質量控制。整個分析過程包括：取樣、樣品傳遞、制樣、儲存、提取、凈化、標準物質及標準溶液（或是帶證標準樣品）、儀器檢測等，都是受控的。所有步驟都會對最終的定量準確度產生影響。

（2）      標準液配制要注意：

（i）          避免使用易揮發的有機溶劑，如乙醚等。

（ii）        目前國內許多實驗室采用容量瓶儲存標準液，由于有些容量瓶的磨口密封性不是很好，所以通常需要用封口膜再密封一下。

（iii）      多種農殘儲備液混合時，要注意避免可能存在的彼此反應。

（3）      殘留分析基本上都有相關法律法規限量要求，因此，分析方法也都對應有推薦標準或指令，最終出具的結果數據必須完全符合相關方法學標準規定的要求。

（4）      由于殘留分析含量都很低，在整個分析過程中都要避免交叉污染。所以，為保證數據準確和對異常數據的判斷，每批分析都必須帶質控點，即：試劑空白、樣品空白、質控樣品（樣品標準添加回收）、標準曲線（內標標準）等，這些數據可以對最終數據準確度的判斷提供幫助。

（5）      最好建立質控圖，有助于發現異常數據。