重組蛋白和多肽的分離純化（5）

2.2.2.2 親和標簽的去除

盡管親和融合策略可以一步使融合蛋白的純度達到很高，但是在蛋白質的下游處理階段又引入了新的問題，即需要位點特異的剪切。在進行融合表達時，以下三種情況是不必去除親和標簽：1. 目標蛋白作為免疫原用來產生和純化抗體;2. 目標蛋白的生物活性不受融合標簽的影響;3. 目標蛋白用來直接固定化在介質上。但如果親和標簽影響了目標蛋白的功能，或為了結構生物學研究和治療用途，就必須在融合標簽和目標蛋白之間加入特異的剪切位點，以便去除親和標簽，可用的方法有化學法和酶法，如表5 所示，在選擇這些方法時除要考慮選擇性等因素外，還要考慮標簽去除后氨基酸的殘留 ，目前C端的標簽沒有很好的方法去除，都會在目標蛋白的C端引入額外的氨基酸，針對N端標簽已有幾種蛋白酶在酶切后可使目標蛋白不帶額外的氨基酸殘基。化學方法廉價，但是常缺乏選擇性，而且使用劇烈的反應條件常使目標蛋白變性失活，使用蛋白酶的優點是反應的條件溫和(中性pH，溫度為4℃到37℃)，特異性強。如果使用蛋白酶進行特異性剪切，在酶切完成后要有相應去除蛋白酶的純化方法，有的重組蛋白酶具有親和標簽，如N端帶有His標簽的腸激酶、二肽氨基肽酶和TEV蛋白酶，可在酶切后使用金屬螯合親和層析去除，N端帶有GST標簽的PreScission蛋白酶，可以用谷胱甘肽親和層析柱去除，還可以將蛋白酶固定化在介質上進行融合蛋白的酶切，使蛋白酶可重復使用。盡管如此，在進行融合蛋白的酶切時會遇到一些特殊的問題，如酶切的效率受到酶切位點空間可及性和周圍氨基酸性質的影響，常存在酶切不完全的現象;某些蛋白在酶切后會出現沉淀;使用內肽酶可引起非特異性剪切的情況，如凝血酶屬于絲氨酸蛋白酶，在精氨酸和賴氨酸殘基后剪切，最優的酶切位點為P4-P3-Pro-Arg↓P1’-P2’(P4和P3為疏水性氨基酸，P1’和P2’ 為非酸性氨基酸)，非特性酶切的情況在表5的注釋里作了說明，而應用廣泛的腸激酶也存在非特異性酶切的現象(92,97)。Jenny等對凝血酶和凝血因子Ⅹa蛋白酶的應用進行了綜述，認為盡管它們在很多應用中能夠在設計的位點進行特異性酶切，但常常會發生目標蛋白其它位點的酶解，所以在去除親和標簽后要對目標蛋白進行鑒定，以確保蛋白的結構沒有發生變化(105)。正是由于酶切以及成本方面的考慮，親和融合策略在工業上應用并不廣泛。

表 5 融合蛋白的剪切方法