重組蛋白和多肽的分離純化（8）

目前對于不同的親和表達純化系統的比較還不多，親和純化的選擇還是多根據經驗來確定，最近Lichty等以純度、產率和花費為指標比較了幾種親和純化標簽的純化效果，認為金屬螯和親和層析容量高，價格便宜，從大腸桿菌提取物中純化組氨酸標簽(His tag)融合蛋白的得率高，純度中等，從酵母、果蠅和Hela細胞的提取物中得到蛋白的純度就較低，對于鈣調蛋白結合肽(CBP)融合蛋白，從大腸桿菌、酵母、果蠅提取物中純化的純度中等，而從Hela細胞提取物中能得到很好的純度，基于表位的標簽FLAG和HPC(蛋白C重鏈)能從4種提取物中得到高純度的蛋白，但使用的介質價格昂貴、吸附容量低，Strep tag Ⅱ標簽融合可以在中等花費的情況下得到相對較好的得率和純度(100)，這方面的研究對于選擇不同的親和標簽提供了很好的實驗基礎。在10-脫乙酰漿果赤霉素Ⅲ-10-氧-乙酰轉移酶(10-DABT)的表達純化中，Fang等比較了GST系統、6×His系統和PinPoint系統對融合蛋白表達和純化的影響，6×His融合蛋白在高濃度誘導物條件下的表達水平最高，但只有25% 的可溶性蛋白，一步純化只得20%的純度，GST融合蛋白表達水平低一些，可溶性蛋白卻占了約80%，親和層析后純度為40%，可生物素化標簽融合蛋白表達水平最低，可溶性蛋白只占40%，親和層析后純度60%，可見不同親和表達純化系統對上游、下游各個階段的影響不一樣，需要綜合平衡考慮(101)。

當前許多生物的基因組測序已經完成，結構基因組和蛋白質組成為研究的主要領域，需要發展大規模和高通量的技術進行蛋白質的表達、純化、活性和結構分析。使用原核系統有許多優點，如易于操作、生長快速、表達水平高，但在原核系統真核蛋白常常不能獲得可溶性表達，主要的原因有以下幾點：1 原核系統沒有真核的分子伴侶;2 原核系統不能進行糖基化等翻譯后修飾;3 不能進行亞細胞定位;4 沒有與其結合起穩定作用的同伴分子。前面我們已經介紹了多種促進蛋白質可溶性表達的方法，但親和融合策略是適應大規模原核可溶性表達最為行之有效的方法。Hammarstr?m等比較了7 種標簽對32種人源蛋白原核表達和可溶性的影響，N端His標簽和GST融合蛋白的表達的比率為59%，Gb1(來源于protein G的Gb1 結構域)、ZZ、NusA(抗轉錄終止因子)和MBP融合蛋白的表達比率在70%-81%，硫氧還蛋白融合蛋白的表達比率達到89%，在表達的27個蛋白(分子量小于20Kda)中，對可溶性的影響順序如下：硫氧還蛋白~Gb1~MBP>ZZ~NusA>GST>6×His，但其中沒有任何一個可以解決所有的可溶性表達問題，所以只有組合應用不同的標簽，才能獲得高的可溶性表達比率(108)。通過對30個哺乳動物全長蛋白和結構域的融合表達研究，Dyson等總結出了幾個與可溶性表達相關的蛋白質特征，包括蛋白的分子量、毗鄰的疏水氨基酸個數、低復雜性區域，而與蛋白的等電點、疏水性平均值(GRAVY)和亞細胞定位無關。N端融合硫氧還蛋白和MBP可以最有效的促進蛋白的可溶性表達，C端的融合標簽中MBP最為有效。使用H10-MBP融合(MBP前面加上10個組氨酸的標簽)，95個蛋白中有63個蛋白可溶性表達的水平大于1mg/l，未成功表達的蛋白大多具有分子量高、毗鄰疏水氨基酸個數多和低復雜性區域多的特征，進一步驗證了前面的結論。所以作者建議如果蛋白具有如下特征：分子量小于30KDa，只含有1或很少數的低復雜性區域，毗鄰疏水氨基酸少于4個，通用的策略是進行N端硫氧還蛋白和MBP融合或C端MBP融合，對于大于50KDa的蛋白，有效的策略是將蛋白質切割表達不同的結構域(107)。

1. 結語

在下游處理過程中，高效的層析技術組成了蛋白質分離純化的骨架，親和的策略在過去的幾十年里得到了快速的發展和廣泛的應用，大大簡化了純化的流程，降低了純化的難度，充分體現了下游技術和上游策略的緊密結合。下游的純化工藝應當立足于對純化蛋白質的最終要求，如純度、穩定性和用途。另外要考慮的就是原材料的性質，包括來源于什么表達系統(如細菌、酵母、哺乳動物細胞)，主要的雜蛋白(如宿主細胞蛋白、產品的不同變體)，需要處理的固體(如細胞、膜碎片、包涵體)，以及蛋白的性質(如所帶電荷、滴定曲線、等電點、分子量、表面疏水性、特異的結合特性和熱穩定性)，這些信息都有助于每一步分離純化工藝的開發。

從我們的論述中，可以看到要得到重組蛋白，可以通過多種途徑，有很多表達純化系統可供選擇，各種系統各有特點和優缺點，這時就要綜合考慮。即使是設計好了表達純化系統，在實際的應用中會遇到新的問題，如選用的表達系統表達水平很低，這種低的表達水平是否在純化上具有優勢，GST融合蛋白可能不是可溶性表達而是包涵體，預先選用的酶切位點存在非特異性酶切，在所用的洗脫條件下蛋白質不穩定，這時就要要根據實際情況來解決問題。