定量PCR Taqman探針設計要領

自90年代Taqman探針誕生以來，雖然熒光探針(引物)不斷有新的技術出現，但是作為一種經典的定量PCR技術，Taqman探針技術仍然是許多實驗研究人員進行定量檢測的首選，這主要是因為相對于SYBR熒光染料，Taqman探針具有序列特異性，只結合到互補區，而且熒光信號與擴增的拷貝數具有一一對應的關系，因此特異性強靈敏度高，而且條件優化容易;而相對于雜交探針，Taqman探針只要設計一條探針，因此探針設計較便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR要求。當然Taqman定量方法由于還是要合成探針，也給實驗操作帶來了挑戰。

一般Taqman定量PCR實驗過程為：目的基因查找比對→探針與引物設計→探針與引物合成→配置反應體系→反應參數→重復實驗，優化條件→獲得曲線數據，比對標準曲線→再重復驗證。

第一步：在第一步目的基因查找比對過程中可以利用NCBI genbank序列以及DNAstar等軟件完成目的DNA或者RNA的查找與比對——這在分析測序報告的時候相信很多人操作過，這一步需要注意的就是要保證所分析的序列在一個contig(重疊群，即染色體的一些區域中毗鄰DNA片段重疊的情況)內。

第二步：如果其它條件一致，那么這個第二步——引物探針的設計就可以說是定量PCR成敗的關鍵了，通過各方面經驗的總結有以下幾個基本的原則：

總體原則

* 先選擇好探針，然后設計引物使其盡可能的靠近探針。

* 所選序列應該高度特異，盡量選擇具有最小二級結構的擴增片段——這是因為二級結構會影響反應效率，而且還會阻礙酶的擴增。建議先進行二級結構檢測，如果不能避免二級結構，那么就要相應提高退火溫度。

* 擴增長度應不超過400bp，理想的最好能在100-150bp內，擴增片段越短，有效的擴增反應就越容易獲得。較短的擴增片段也容易保證分析的一致性。

* 保持GC含量在20%和80%之間，GC富含區容易產生非特異反應，從而會導致擴增效率的降低，以及出現在熒光染料分析中非特異信號。

* 為了保證效率和重復性，應避免重復的核苷酸序列，尤其是G(不能有4個連續的G)

* 將引物和探針互相進行配對檢測，以避免二聚體和發卡結構的形成。

引物設計原則

* 序列選取應在基因的保守區段

* 避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續配對，避免引物自身形成環狀發卡結構

* 典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，并降低序列存在于非目的序列位點的可能性。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產量。

* Tm值在55-65℃(因為60℃核酸外切酶活性最高)，GC含量在40%-60%

* 引物之間的TM相差避免超過2℃

* 引物的3’端避免使用堿基A，引物的3’端避免出現3個或3個以上連續相同的堿基

* 為避免的擴增，引物設計最好能跨兩個外顯子。

* Taqman探針技術要求片段長度在50bp-150bp

* 引物末端(最后5個核苷酸)不能有超過2個的G和C。

探針設計原則

* 探針位置盡可能地靠近上游引物

* 探針長度應在15-45bp(最好是20-30bp)，以保證結合特異性

* 檢測探針的DNA折疊和二級結構

* Tm值在65-70℃，通常比引物TM值高5-10℃(至少要5℃)，GC含量在40%-70%

* 探針的5’端應避免使用G鳥嘌呤——因為5'G會有淬滅作用，而且即使是被切割下來還會存在淬滅作用。

* 整條探針中，堿基C的含量要明顯高于G的含量——G含量高會降低反應效率，這時就應選擇配對的另一條鏈作為探針。

* 為確保引物探針的特異性，最好將設計好的序列在blast中核實一次，如果發現有非特異性互補區，建議重新設計引物探針。

Taqman MGB 探針設計

* 探針的5’端避免出現G，即使探針水解為單個堿基，與報告基團相相連的G堿基仍可淬滅基團的熒光信號。

* Tm值應為65-67℃。

* 盡量縮短Taqman MGB探針，但探針長度不少于13bp。

* 盡量避免出現重復的堿基，尤其是G堿基，應避免出現4個或4個以上的G重復出現。

* 原則上MGB探針只要有一個堿基突變，MGB探針就會檢測到(MGB探針將不會與目的片段雜交，不產生熒光信號)。因此，在進行SNP檢測時，為了檢測到突變子，即Taqman MGB不與目的片段雜交，不產生熒光信號，探針目的片段產生熒光信號檢測將探針的突變位點盡量放在中間1/3的地方。

注意：為了滿足上述要求的4個條件，探針的突變位點可向3’端移動，但突變位點至少在離3’端2個堿基的前方(即必須確保探針的后兩個堿基是絕對的保守)，以進行SNP檢測。反過來，若要進行同類檢測，找的是保守片段區，探針中不應有突變位點。若探針即便是只有13個bp，探針仍不完全保守。有幾個突變，突變位點也應靠近探針的5’端，這樣，即便是突變，探針也可與目的片段雜交，產生熒光信號。另一種方法是設計簡并探針，也可達到即使是突變，仍可檢測到突變。

第三步：尋找一家信賴的公司合成引物和探針，一般引物合成大家比較熟悉，而且價格也比較便宜(特別是這兩年便宜了許多)，而探針則相對來說貴了許多，一般Taqman探針合成在1000到5000元不等(不同的合成要求價錢不同)——而這只是標記價錢，序列合成基本上和引物合成價錢相似。

第四、五、六步：一般的定量PCR反應體系與普通PCR其實也差不了多少，只是要加入Taqman探針，另外不同就是分步法的不同。其中需要注意的是：

* 擴增酶最好選用熱啟動酶

* 引物和探針的濃度需要進行優化，有人建議從50nM開始，在50nM—900nM之間優化，一般為200nM(注意探針需要避光保存。

* 同樣Mg 和酶量也需要進行優化，酶的推薦反應濃度是1.25-1.5U(50ul)

* DNA模板的添加量通常在100 ng以下，因不同種類的DNA模板中含有的靶基因的拷貝數不同，必要時可進行梯度稀釋，確定最佳的DNA模板添加量。如果欲進行2 Step RT-PCR反應的第二步PCR擴增反應，第一步的RT反應液作為DNA模板時的添加量不要超過PCR反應液總體積的10%。

另外循環參數雖然在引物和探針設計完之后也就確定了，但是有時也需要進行優化。

第七步：在進行數據分析的時候，通常用不同濃度的標準樣品的Ct值來產生標準曲線，然后計算相對方程式。方程式的斜

度可以用來檢查PCR的效率，對于100%PCR效率來說，一個理想的斜率是3.32。最佳的標準曲線是建立在PCR的擴增效率為90%-100 %(100%意味著在每個循環之后，模板的總數將增加為前一次的2倍)的基礎上。所有標準曲線的線性回歸分析需要存在一個高相關系數(R2≥0.99) ，這樣才能認為實驗的過程和數據是可信的。使用這個方程式我們可以計算出未知樣本的初始模板量。大多數定量PCR儀都有這樣一個軟件，它可以從標準曲線中自動地計算出未知樣本的初始模板量。

這其中有兩種基本的方法：絕對定量和相對定量，研究人員需要根據自己的實驗目的來選擇。絕對定量是指將未知樣品與標準曲線相比較進行分析，一般標準品就是一個已知絕對濃度的DNA樣品，要注意得是絕對定量分析的準確性是相對標準品的準確性而言的。相對定量是指兩個或更多的基因互相進行比較，其結果是一個比率，沒有確切的數字被檢測道。

另外由于不同的樣品在反應過程中存在著一定的差異，因此除了要制作標準曲線來進行定量外，還需要設計表達水平相對較為穩定的內參基因來對結果進行標準化。β-actin 和三磷酸甘油醛脫氫酶( Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ，GAPDH) 是兩種較常用的管家基因，另外還有cyclophilin，18sr RNA ，phosphoglyserokinase，beta-microglobulin，beta-glucronidase，hypoxanthine ribosyl transferase，transferring receptor 等。要注意這些基因可以被反應條件所影響，在設計定量表達研究時，保證初始對照基因的質量是必要的一步，而且嚴謹的研究人員會通過對一系列內參基因定量結果取幾何平均數來對定量數據進行標準化。

還有一個問題就是如何判斷所得到數據的好壞，關于擴增曲線，經驗總結認為：

“1. 總體看曲線拐點清楚，指數期明顯，擴增曲線整體平行性極好，基線平無上揚現象，低濃度樣本擴增曲線指數期明顯。

2. 曲線指數期斜率，反應了擴增效率，越大說明擴增效率越高。擴增效率越高，試劑靈敏度表現會越好。

3. 基線，圖上的基線也就是陰性樣本的擴增曲線，平直或略微下降是好試劑的表現，陰陽性清楚，不易誤判。如果有上揚趨勢，有可能造成陰性標本誤判。

4. 曲線與曲線間平行性非常好，說明各反應管擴增效率相近，外標準定量建立在每管擴增效率一樣的假定基礎上，所以擴增效率越相近，定量的重復性和準確性就越好。而擴增效率相近與否，反應在擴增曲線圖上就是曲線的平行性。

5. 低濃度曲線指數期明顯，一方面不易出現假陰陽性誤判，另一方面說明靈敏度高。”