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  • 定量PCR Taqman探針試劑之選

    上一篇 / 下一篇  2008-08-24 23:50:43/ 個人分類:PCR實驗

    由于ABI公司在定量PCR領域的領導地位和在推廣定量PCR技術上的貢獻,Taqman探針可以說是當下熒光定量PCR中使用最多最廣的方法之一,特別是在臨床疾病檢測上。我們大致可將產品分為2大類,一是已經帶有標記探針的特定基因的定量PCR試劑盒,最常見的是疾病/病原檢測相關的基因,比如EBV病毒、SARS病毒檢測試劑盒等等,這種試劑盒只要配合特定的機器按照說明書直接用就好,既省心又可靠。國外著名的公司有Artus,是當年最早推出SARS定量檢測試劑盒的公司,國內自然是首推達安基因了,另外被Qiagen收購的深圳匹基公司的定量PCR試劑也頗有名氣。這類產品因為已經驗證,不需要另外購置試劑,而且比免疫法能更早檢測出病原(不用等待機體產生抗原),加上通常成本由病人買單,推廣得很快。

    不過科研人員就沒那么好運了,科研中需要用到定量PCR檢測的目標廣泛,不容易找到帶有探針的定量檢測試劑盒。當然,針對這種現狀,幾個大公司陸續推出探針庫,比如羅氏的UPL通用探針庫,就可以通過組合定量檢測出人、大小鼠等7個物種的大部分ORF序列,特別適合大型實驗室;ABI公司現在可以根據用戶的需要提供約十二萬種基因表達引物、探針和兩百多萬種SNP分析的引物探針進行科學研究,據說是源自于世界各地研究人員要求定制探針或者引物后匯總的結果,可惜就是貴,就連美國的實驗室教授也大嘆“Very expensive, especially for small projects”。

    咱們做實驗的,對試劑的要求自然是1.質量可靠 2.價格相宜,前者保證實驗早出結果,出好結果,不要太多折磨,后者則是要老板承受得起,畢竟沒有病人替我們買單。因此自行設計定制標記探針就是多數“第三世界”實驗室的選擇。Taqman探針法的第二大類產品就是不帶探針引物的通用探針法定量檢測試劑盒——有酶、Buffer、內參等等配套試劑,模版引物探針自備。大家關心的問題不外是:1.哪一家探針合成標記比較可靠、價格如何?2.哪一家的通用試劑盒比較可靠價格相宜?是不是一定要買試劑盒?對于第一個問題,生物通希望有經驗的讀者參與我們的網絡調查,當搜集到足夠樣本時我們會將大家的意見更新在本文后面,對于第二個問題,生物通在這里簡單介紹一下市面常見的品牌和特色。

    [基礎用途]就是指基因表達量檢測方面而言。

    其中不肖說ABI是個金字招牌,它的優點就在于無論你是要做人類的,小鼠的,大鼠的,果蠅的,線蟲的還是植物擬南芥的,連序列都不用呈遞,只要把基因名字說出來就行了,除了基因序列全面完整之外,ABI的試劑的各方面的條件也是摸索優化好了的,基本上只要不出大的問題——比如說儀器出錯,樣品制備得太差——ABI的這些試劑都可以得到不錯的結果。但是缺點就是貴(200個反應4500),以及時間周期比較長,不過如果你希望能發到高點數的文章,這些時間金錢可能還是省不了的。

    在ABI的這些試劑盒中一般都包括AmpliTaq或者AmpErase金牌酶(具體見定量PCR:“酶”頭一蹙,計上心來 Qiagen vs.ABI(1)),緩沖液,對照等,另外如果是RT-PCR試劑盒還會有逆轉錄酶——這里有個一步法和兩步法的區別,一般而言兩步法較靈活,一次cDNA反應可以進行多次PCR反應,而一步法就相對簡單快速。ABI有個通用型的一步法試劑盒(Universal PCR Master Mix),這個試劑盒其實也就是Core Reagents試劑盒的成份,但是已經預混合起來的,并且在此基礎上加入了一些額外的成份幫助完成簡單高效的Taqman探針定量PCR反應,反響不錯,甚至對于一些“刻薄”的G/C富集的模板也得到了相當不錯的結果。

    Qiagen的Quantitect Probe PCR/RT-PCR也是一個基于探針的定量PCR通用試劑盒。酶自然也是選擇嚴格的Hotstart酶,試劑盒同時提供熒光內參、dNTP和優化緩沖液,價格要30元/次反應(50ul,如果你把反應體積減少到25ul,就可以將成本再減半),如果你是生物通新聞欄目的幸運讀者能拿到最近生物通送出的優惠券,那幾乎可以又便宜一半。如果你要做Multiplex多重PCR,或者同管內檢測目的基因和管家基因,那么你還是不要再幻想自己配試劑了,QuantiTect Multiplex PCR應該是更好的選擇。這個每管最多可做4個模版、檢測靈敏度低至10個拷貝也能檢測出來、已經優化穩定可靠的試劑每次成本40多元,優惠下來22左右,如果將反應體積減半還可以便宜到10元多點兒。比起自己慢慢摸索要快得多。可以選擇有ROX內參熒光或者無ROX的試劑盒(如果你的機器不是ABI,不要ROX干擾也罷),價格是一樣的。

    Stratagene的Brilliant系列則是以Core Reagent和MasterMix的形式提供(其實后者就是預混好的試劑,方便一些;前者就是各自分開的試劑,要自己混合,不過可以自己調整份量)。這一系列產品不單可用于Taqman探針法,還可以Scorpions,Amplifluor、雜交雙探針法和分子信標等等,實在是非常通用的選擇,同樣都是嚴格熱啟動Taq酶,優化的試劑,可靠的公司信譽,還可以選擇有dUTP UNG的Plus配方。Brilliant的RT定量系列還分有單管和兩步法可供選擇。價格也和Qiagen不相上下,同樣是50ul一次的反應原價是30多元,6月底前特價6折,如果反應體系25ul成本就降到9塊錢左右。Brilliant的MultiPlex比Qiagen的便宜,也可以做4個target,原價是30塊左右一次,生物通上6月特價是15塊左右,反應體積減半價格就去到8塊左右啦,價格直逼國產試劑。如果你是Stratagene的粉絲,就不要錯過這個機會。

    說實話,羅氏的雜交探針確實比Taqman更可靠,只是一直沒有得到很好的推廣。Roche主推雜交探針,但也沒有忽略Taqman的市場,LightCycler TaqMan Master則是配合其LightCycler? 2.0 System Instruments推出的一套試劑盒(也可以在其它定量PCR儀器上使用,比如ABI的7500),LightCycler本身就以速度著稱,而這個試劑盒以玻璃毛細管的形式提供,配合了熱啟動酶和優化Buffer,進一步提升了實驗的速度,這兩者的結合應該是目前所知定量PCR(或者RT-PCR)反應的“速度之王”了吧。就是價格比較嚇人。

    同類的產品還有不少,由于原理都差不多,就不一一列舉。

    [拓展用途]Taqman不僅在深度上得到了充分應用,而且逐漸也擴增了其廣度。這一方面體現的特別顯著的就是ABI的試劑了。

    ABI號稱有數以千記的Taqman試劑盒,除了上面提到的用于一般基因表達量分析的PCR或RT-PCR的試劑盒外,還有SNP分型,低密度表達譜試劑盒,miRNA,藥物代謝等。其中TaqMan? Low Density Arrays主要用于配合芯片使用,即在檢測之后進行的進一步鑒定,其特點就是方便和節省試劑,而用于SNP分型的則包括Custom TaqMan SNP Genotyping Assays、TaqMan Drug Metabolism Genotyping Assays、TaqMan Pre-Developed Assay Reagents for Allelic Discrimination和TaqMan SNP Genotyping Assays四種,其中可以用于基礎和臨床研究的藥物代謝基因分型試劑盒是目前唯一的一種可以用于藥物篩選的SNP分析Taqman試劑盒,主要原理是利用涵蓋了220個編碼藥物代謝的酶(DMEs)和相關轉運蛋白的基因的2000多個位點,融合Taqman等位基因分辨技術進行多態性分析(見定量PCR Taqman探針的應用[高級篇])。

    此外還有miRNA表達試劑盒,這一款ABI去年推出的試劑盒在其未商品化之前其實就已經進入實驗室了,去年歐洲協會的人類遺傳學年會就有實驗室展示了利用這個產品獲得的實驗結果,其最重要的特征就是可以將成熟miRNA和前體區分開來,獲得準確的分析結果,目前共有兩款產品可供選擇:Human Panel – Early Access Kit和ABM 000008 hsa-miR-16。

    此外,除了Taqman探針法,羅氏的雜交探針是科研上更為嚴謹的選擇,而試劑的選擇自然以羅氏為主。Stratagene的Brilliant系列不單可以用于雜交探針,還可以用于分子信標、Scorpions,Amplifluor等其他的標記方法,如果你打算采用Taqman以外的方法,Brilliant是不錯的選擇。


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