plasmid DNA的抽提?純化試劑盒-MagExtractor?-Plasmid

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中文名稱：plasmid DNA的抽提?純化試劑盒

英文名稱：MagExtractor?-Plasmid-

產品編號：NPK - 300

產品類別：分子生物學

生產廠家：TOYOBO

產品價格：300

產品規格：50次

Nucleic Acid Purification Kit

MagExtractor

-Plasmid-

使用說明書

(Code No. : NPK - 301)

TOYOBO CO. , LTD. Biochemical Operation Department

OSAKA JAPAN

—目錄—

[1] 前言............................................................................................................................. 1

[2] 使用前須知................................................................................................................. 1

[3] 試劑盒中所包含的物品............................................................................................. 2

[4] 操作程序..................................................................................................................... 2

1.試劑盒以外所需要的其他物品.......................................................................... 2

(1)試劑............................................................................................................. 2

(2)器具·器材................................................................................................. 2

2.抽提流程.............................................................................................................. 3

3.宿主菌的培養...................................................................................................... 3

4.集菌...................................................................................................................... 4

5.試劑的制備.......................................................................................................... 5

6.用MFX-2000抽提DNA的方法....................................................................... 5

(1)操作程序的選擇......................................................................................... 5

(2)加溫block，回收block的溫度設定....................................................... 6

(3)附帶專用過濾器的tip頭設置................................................................... 6

(4)專用試管的設置......................................................................................... 7

(5)試劑的設置................................................................................................. 8

(6)樣品的前處理及其設置........................................................................... 10

(7)抽提開始................................................................................................... 11

(8)樣品的回收............................................................................................... 11

(9)根據操作手冊抽提plasmid DNA的方法............................................ 12

[5] 一般樣品的分析....................................................................................................... 13

(1)A260，A280及A320的測定......................................................................... 13

(2)電泳........................................................................................................... 13

(3)DNA測序................................................................................................. 13

[6] 疑難解答................................................................................................................... 14

1.使用MFX-2000的場合................................................................................... 14

2.手動操作的場合............................................................................................... 14

注意：

本試劑盒中所包含的試劑都是研究用試劑。請不要用于診斷，臨床等場合。在使用本試劑盒的時候，請嚴格遵守實驗室的基本注意事項，并注意安全。

[1] 前言

MagExtractor -Plasmid-利用在Chaotrpic(鹽)試劑存在的情況下，核酸能吸附在硅膠表面的特性，進行plasmid DNA的抽提·純化。磁性體使用的是封入的磁珠，所以能夠利用永久磁石很容易地分離回收核酸。磁珠依據吸附條件，分別對蛋白質，DNA，RNA等不同物質具有不同的吸附能力，所以能夠簡便地純化核酸。本試劑盒除了作為用于全自動核酸抽提裝置MFX-2000的試劑外，也可以作為手動抽提試劑盒來使用。

性能·特征

·能夠從大腸菌中抽提·純化出plasmid DNA

·能夠回收3～6μg的plasmid DNA(50～150ng/μl)*1，可用于轉化，限制酶處理，DNA 測序反應等。

·能在10～15min之內抽提出plasmid DNA。

·不使用苯酚、氯仿等危險溶液。

·無需乙醇沉淀。

[2] 使用前須知

1)注意

MagExtractor -Plasmid-準備了四種對應于MFX-2000，二種對應于手動的操作程序。使用對磁珠不進行干燥處理的操作程序(手動操作程序Ⅰ以及MFX-2000的”Speedy”和”Lowcost”等操作程序)所得到的回收液，需要注意以下幾點。

·對于限制酶及轉化處理，可直接加以使用。

·瓊脂糖電泳時的Loading Dye必須使用本試劑盒附帶的產品。使

用一般的產品組分時，可能樣品會無法沉淀。

·當用于DNA測序時的模板時，乙醇會阻礙測序反應，可將回收液置于1.5ml試管內，保持試管打開狀態加溫至78℃ 40min。(也可只加溫處理必要的劑量。參考13頁。)

·為了不讓乙醇混入回收液中，請使用手動操作程序Ⅱ(參

考12～13頁)，如果是MFX-2000的場合下，請使用”Dryup”

或”Fullauto”等操作程序。

*1 從M109/pUC19過夜培養液中進行抽提的場合。

[3] 試劑盒中所包含的物品

本試劑盒中含有能夠進行500次plasmid DNA回收的試劑量。

130 x 2ml........ 吸附液(含有蛋白質變性劑)............................................ 4℃或者室溫下保存

16ml........ 磁珠Ⅰ............................................................................. 4℃或者室溫下保存

16ml........ 磁珠Ⅱ............................................................................. 4℃或者室溫下保存

80ml........ 再懸浮液....................................................................................... 4℃下保存

80ml........ 溶解液Ⅰ(含有蛋白質變性劑)........................................ 4℃或者室溫下保存

20ml........ 溶解液Ⅱ(含有蛋白質變性劑)...................................................... 4℃下保存

65ml........ 中和液............................................................................. 4℃或者室溫下保存

60ml........ 溶出液.......................................................................................... 4℃下保存

11ml........ 5 x Loading Dye........................................................................... 4℃下保存

·試劑如果沾在手或衣服上或使用后，請徹底用清水清洗。萬一不慎進入眼睛，立刻

用清水徹底清洗，然后去看醫生。

·溶解液Ⅰ有時會產生析出物。請在室溫～40℃下完全溶解后再使用。

·溶解液Ⅰ，Ⅱ的混合液在室溫下保存超過三個星期后請不要再使用。*1溶解液Ⅰ，Ⅱ以外的試

劑請在4℃下保存。

·使用本公司的核酸自動抽提裝置MFX-2000的情況下，請在指定的瓶中注入必要的劑量，置于指定部位。詳細方法請參考MFX-2000的使用說明書。

[4] 操作程序

1.試劑盒以外所需要的其他物品

(1)試劑

·滅菌水(蒸餾水或者milliQ水經過高溫高壓濕熱滅菌)

·乙醇溶液(99.5%以上的特級品，使用手動法的時候用70%

的乙醇溶液)

(2)器具·器材

·微量移液器

·微量移液器用的tip頭

使用MFX-2000的場合，必須配備以下物品。

·抽提專用試管(Code No：MFX-301)

·抽提專用6連試管(Code No：MFX-302)

·附帶專用過濾器的tip頭(Code No：MFX-402)

*1 有時plasmid DNA的回收量及純度會發生降低。

·試劑設置用試管(50ml用，15ml用，2ml用*1)

使用手動法的場合，必須配備以下物品

·1.5ml小型試管用的磁性臺架(商店有售)

·漩渦混合器或者小型試管混合器

·簡易臺式離心機(12,000r.p.m.)

2.抽提流程

MagExtractor -Plasmid-通過以下五個工序對Plasmid DNA進行抽提和純化。

①集菌

②堿溶菌

③中和

④通過磁珠Ⅰ去除菌體殘渣

⑤通過磁珠Ⅱ分解，純化Plasmid DNA

使用MagExtractor -Plasmid-和MFX-2000時，上述的②～⑤可成為自動化操作。

3.宿主菌的培養

培養含Plasmid DNA的大腸桿菌。培養基可使用和通過LB，TB等堿性SDS法等方法來抽提Plasmid DNA的時候同樣的培養基。由于Plasmid的回收量受拷貝數量以及菌體數量影響，推薦使用使MagExtractor -Plasmid-能夠使回收量更加穩定的MMI培養基。使用MMI培養基的情況下，菌體量和TB的情況等同(JM109 / pUC18，50μg / ml氨芐青霉素9～11O.D.)。

MMI培養基的配制方法

|←蒸餾水800ml

|←13g Bacto trypton

|←25g Bacto yeast extract

|←8.5g NaCl

|←4ml 丙三醇

|←20ml 1M Tris-HCI，pH7.2

| 加蒸餾水到1000ml

| 高溫高壓濕熱滅菌

*1 50ml，15ml試管請使用BECTON DICKINSON公司生產的BLUE MAX

2170,BLUE MAX 2196,2m試管請使用本公司生產的NO.72.693。

4.集菌

使用MagExtractor -Plasmid-能夠處理的菌體量在手動法時是12～13O.D.，使用MFX-2000時是5～9 O.D.。根據菌體量和抽提方法的不同所引起的回收量的不同可以參考下圖所示。在使用MFX-2000處理10 O.D.以上的劑量時，有可能會無法進行充分的攪拌(pipetting)，使得純度下降，請務必注意。使用angle rotor對1.5ml試管進行集菌時，菌體量請按照圖2所示為標準。

·請將培養液置于1.5ml試管中。

·請用12,000rpm離心分離2min。

·請仔細去除上清部分。

手動法

MFX-2000

菌體量(O.D.)

圖1：菌體量的不同引起的回收量的變化(JM109 / pUC18，MMI培養液)

過少 適量 過多

圖2：菌體量的標準

5.試劑的制備

·溶解液

請按照4:1(v:v)的比例對試劑盒中的溶解液Ⅰ*1，Ⅱ進行混合。請將此混合液在室溫下保存，三周后請勿繼續使用*2。通過手動法抽提的時候需要150μg / 樣品。使用MFX-2000的時候，請參考第九頁的表【各試劑的使用劑量標準】進行制備。

·70%乙醇溶液

只有在使用手動法的時候使用。需要1500μg / 樣品。

6.使用MFX-2000抽提Plasmid DNA的方法

在使用MFX-2000前，請務必閱讀MFX-2000的使用說明書。使用抽提程序中的”Dryup”或”Fullauto”程序時，需要有加溫的功能*3。請使用標準式樣(加溫，簡易保溫功能 / Code No.：MFX-102)或者是特殊式樣(加溫，電子冷卻功能 / Code No：MFX-103)。

(1)操作程序的選擇

MFX-2000中準備了4種可供抽提Plasmid DNA用的操作程序。選擇其中一個，將其號碼輸入在液晶畫面中。

·一次操作只能選擇其中一個操作程序。

·下表的抽提時間不包含分裝時間。實際的抽提時間根據樣品不同

會有所變化，以下表的抽提時間 x 樣品數 x 1.25(小時)為標準。

號碼

液晶畫面的第3行顯示的內容

樣品抽提

時間用途*1

AB

31[Plasmid： Speedy]再次懸濁液10min○?*2

32[Plasmid： Dryup]再次懸濁液15min○○

33[Plasmid： Fullauto]集菌后的菌體16min○○

34[Plasmid： Lowcost]菌體抽提液6min○?

*1 用途A：用于限制酶處理，轉化

用途B：DNA 測序，或使用回收液超過50%時的反應。

*2 通過手動法進行去除乙醇的操作后便可以進行DNA 測序。

*1 有析出物的場合，請在室溫～40℃中徹底溶解。

*2 Plasmid DNA的回收量和純度有時會降低。

*3 如果只使用”Dryup”或”Fullauto”操作程序，請使用基本樣式的

MFX-2000(簡易保溫功能 / Code：MFX-101)。

·操作程序 “31：Speed”

適用于限制酶處理以及轉化用Plasmid DNA的制備。將再次懸濁液置于MFX-2000中，大約在10min / 樣品下抽提出Plasmid。

·操作程序 “32：Dryup” “33：Fullauto”

適用于DNA 測序用Plasmid DNA的制備。處理較多菌體(7～9O.D.)時適合使用針對再次懸濁液的 “32：Dryup”，處理較少菌

時(5～6O.D.)時適合使用針對集菌后的菌體的“33：Fullauto”。

·操作程序 “34：Lowcost”

使用通過以下的操作設置處理過的樣品。由于僅使用專用試管1個/樣品(其他操作程序時3～4個)，故能夠以較低成本回收Plasmid DNA，

并能夠在6min / 樣品下實現限制酶處理，以及轉化用的Plasmid DNA的制備。

集菌后的菌體

|←150μl再次懸浮液

| 用漩渦混合器攪拌60sec

|←150μl溶解液(溶解液Ⅰ，Ⅱ按4：1(v：v)的比例混合后的溶液)

| 反復顛倒試管5次以實現攪拌

| 放置于冰上5min

|←120μl中和液

| 反復顛倒試管5次以實現攪拌

| 放置于冰上5min

| 12,000rpm，10min

設定MFX-2000

(2)加溫block，回收block的溫度設定*1

加溫block冷卻block

溫度設定78℃10℃

·簡易冷卻時，冷卻block應事先在冷藏庫或者冷凍庫內冷卻。

(3)附帶專用過濾器的tip頭設置

·請使用附帶專用過濾器的tip頭(Code No：MFX-402)

·tip已通過γ射線滅菌。戴上手套將需要量專用tip安裝在tip架中。

·關于tip的安裝位置請閱讀MFX-2000的使用說明書。

*1 設定方法請閱讀MFX-2000的使用說明書。

·將需要量專用tip安裝在tip架中。

tip數tip數

操作程序號31323334操作程序號31323334

樣品數11011115樣品數1361747426

213151561464787827

316191971567828228

419232381670868629

5273232121778959533

6303636131881999934

733404014198410310335

836444415208710710736

944535319219511611640

1047575720229812012041

11506161212310112412442

12536565222410412812843

(4)專用試管的設置

·請將專用試管設置在抽提架中。擺放位置根據操作程序的不同

而有所差異，請按照下表放置試管。

操作程序號擺放場所

31～33A. B. C. D. E. F

34A. B. C. D

·請對加溫block(只限于操作程序32，33)，回收block設置所需樣品數。

·對抽提架的A～F以及加溫block，請勿使用專用試管以外的其他

試管。否則有可能會產生故障。

·對于回收block，請使用Assist公司的No.72.730試管。*1

*1 對于回收block，除了MFX-2000專用試管外，帶螺旋式蓋的1.5ml試管Assist試管No.72.692等也能使用。由于回收液中會有不同程度的磁珠殘留，回收液超過50%的場合下，請對這些試管進行12,000rpm×2min的離心操作(如果回收液在反應液中的比例小于50%則不會存在問題。)

(5)試劑的設置

·本試劑盒內不含有滅菌水和乙醇溶液(99.5%以上的特級品)，請

自己準備。

·請準備50ml容量試管FALCON 2170，15ml容量試管FALCON

2196，2ml容量試管Assist試管No.72.694。*1

·根據樣品數的不同所需的試劑量也會不同。請根據第九頁的表，在

指定試管內注入所需試劑的必要劑量。

·注入試劑時請以試管上的刻度為標準。

·視操作程序，有可能不需要安裝某些試劑。

·將各試管放置在試劑架中。請將磁珠Ⅰ，Ⅱ再次搖勻，放置

在試劑架處。磁珠設置好后，請立刻啟動裝置(10分鐘以內)。

(否則將產生回收量參差不齊及操作故障。)

·抽提后剩下的試劑可以再次使用(可追加減去的量并設置在MFX-2000上)。如果不再接下去使用，請將蓋子蓋好保存。如果長時間處于蓋子打開狀態，液體的組成成分有可能會起變化。

·使用的劑量請不要超過第九頁表中記載的規定劑量。這是造成試管

塞污染以及液體溢出的原因。

*1 使用其他物品會造成儀器運作不穩定。

【樣品數在1～12時的試劑使用劑量】

試劑名試管容量分裝量(ml)設置

位置

操作程序號

31323334

吸附液50ml252525251

滅菌水50ml252525252

乙醇溶液50ml252525256

磁珠Ⅰ2ml1.51.51.5不要7

磁珠Ⅱ2ml1.51.51.51.58

再次懸濁液15ml不要不要5不要9

溶解液15ml555不要10

中和液15ml555不要11

溶出液15ml555512

【樣品數在13～24時的試劑使用劑量】

試劑名試管

容量分裝量(ml)設置

位置

操作程序號

31323334

吸附液50ml252525251

滅菌水50ml252525252

乙醇溶液50ml505050506

磁珠Ⅰ2ml1.51.51.5不要7

磁珠Ⅱ2ml1.51.51.51.58

再次懸濁液15ml不要不要5不要9

溶解液15ml555不要10

中和液15ml555不要11

溶出液15ml555512

(6)樣品的前處理及其設置

根據操作程序需要對以下樣品進行前期處理。

①使用程序31,32時

集菌后的菌體

|←150μl再次懸濁液

| 用漩渦混合器攪拌60sec

置于樣品孔

②使用程序33時

·把集菌后的菌體原樣放入樣品孔。

③使用程序34時

集菌后的菌體

|←150μl再次懸濁液

| 用漩渦混合器攪拌60sec

|←150μl溶解液(溶解液Ⅰ，Ⅱ按4:1(v:v)比例混合后的溶液)

| 反復顛倒試管5次以攪拌

| 放置于冰上5min

|←120μl中和液

| 反復顛倒試管5次以攪拌

| 放置于冰上5min

| 12,000rpm，10min

置于樣品孔*1

·將樣品放入樣品孔時，請保持試管蓋開啟狀態(1～24號樣品的樣

品孔上印有號碼)。

·樣品試管使用通常的1.5ml試管時，請先用剪子如下圖所示進行剪斷后再使用。剪斷的時候請務必注意安全。

請在此處剪斷

*1 菌體殘渣留在試管壁上時，試管仍然可以繼續使用。由于rotor有時會使得菌體殘渣留在試管底部，所以請將上清液置于其他試管后再進行使用。

(7)抽提開始

·請確認樣品，試劑試管(試劑量)，試管種類，專用tip等是否已

按說明書所示安裝完畢。

·抽提之前，請先將tip廢棄盒清空。

·確認各臺架的安裝位置(鎖定)，確認操作臺是否已完全收納到里

面，并將前門關閉。

·在液晶畫面上輸入操作程序的號碼以及樣品數。

·確認顯示有“請按下開始鍵”的畫面內容后，按下“START”

按鍵。

·抽提操作開始時，液晶畫面會顯示“操作中”字樣。

·手伸進驅動部位會有危險，因此操作中請務必關好前門，不要開啟。

(8)樣品回收

·所有抽提操作結束后，會再次顯示“請按下開始鍵”字樣的畫面。

·抽提的DNA被回收block上的試管回收。確認裝置完全停止運行

后，從回收block塊上取出試管，將其在低溫(4～10℃)下保存，直至使用為止。

·如果回收液中混入少量的磁珠，仍可以直接使用。

·從加溫block上取出試管時，請確認加溫block的開關是否已關閉并且溫度已下降至40℃以下。如果在加溫block尚熱的時候去取試管，有可能發生燙傷。

(9)通過手動法抽提plasmid DNA的方法

①操作程序Ⅰ(限制酶處理，轉化等級)

集菌后的菌體

|←150μl再次懸濁液

| 用漩渦混合器攪拌60sec

|←150μl溶解液(溶解液Ⅰ，Ⅱ按4:1(v:v)比例混合后的溶液)

| 反復顛倒試管5次以攪拌

| 放置于冰上5min

|←120μl中和液

| 反復顛倒試管5次以攪拌

| 放置于冰上5min

| 12,000rpm，5min

| 將上清液放入新的1.5ml試管中

|←500μl吸附液

|←30μl磁珠Ⅱ(反復顛倒攪拌，使其均勻混合)

| 攪拌60sec *1

| B/F分離 *2

|←720μl70%乙醇溶液

| 攪拌30sec 重復兩次

| B/F分離

|←50μl溶出液

| 攪拌60sec

| 12,000rpm，5min

| B/F分離

上清液

②操作程序Ⅱ(DNA 測序等級)

集菌后的菌體

|←150μl再次懸濁液

| 用漩渦混合器攪拌60sec

|←150μl溶解液(溶解液Ⅰ，Ⅱ按4:1(v:v)比例混合后的溶液)

| 反復顛倒試管5次以攪拌

| 放置于冰上5min

|←120μl中和液

| 反復顛倒試管5次以攪拌

*1 將攪拌強度設為最大，在室溫下用漩渦混合器或試管混合器進行攪

拌。

*2 將試管置于磁性臺架上，磁珠靠近磁石，多次顛倒混合，使得蓋子

上的磁珠完全貼近磁石。然后，輕輕震動磁性臺架，使得粘在蓋子上

的溶液摔落下來。用微量移液器吸棄上清部分。

| 放置于冰上5min

| 12,000rpm，5min

| 將上清液放入新的1.5ml試管中

|←500μl吸附液

|←30μl磁珠Ⅱ(反復顛倒攪拌，使其均勻混合)

| 攪拌60sec

| B/F分離

|←720μl70%乙醇溶液

| 攪拌30sec 重復兩次

| B/F分離

|←500μl乙醇溶液

| 攪拌30sec

| B/F分離

| 78℃，15min(使磁珠干燥)

|←50μl溶出液

| 攪拌60sec

| 12,000rpm，5min

| B/F分離

上清液

[5] 一般樣品的分析

(1)A260，A280，A320的測定

·請將回收液瞬時高速離心后進行測定。

·請用TE緩沖液的10～30倍稀釋后進行測定。

(2)電泳

·5x Loading Dye：樣品：電泳緩沖液=按2：3：5～2：7：1比

例稀釋。

(3)DNA 測序

·按照操作程序32，33抽提出的DNA以及按照手動操作程序Ⅱ抽提出的DNA，請使用5～10μl用于反應。

·按照操作程序31，34抽提出的DNA以及按照手動操作程序Ⅰ抽提出的DNA，其中混有10%濃度的乙醇溶液，會阻礙測序反應，請先去除乙醇。

·將樣品15μl注入到0.5ml試管內。

·以78℃的溫度加溫直至液體蒸發完(約15min)，然后用此試管混

合反應液。

[6] 疑難解答

1.使用MFX-2000的場合

(1)plasmid DNA的回收量少，純度差

原因對策

試劑量不足在C, D, E孔中B/F分離后會分別剩下800μl，720μl及720μl 左右的試劑。如果此溶液量過少的話，則原因是使用的試劑量不足。請加液到規定劑量。如果回收液過少或者沒有，有可能是沒有安裝溶出液或溶出液少的緣故。

樣品量過多A, B孔的抽提試管中剩有50μl以上的液體時，可能是因為菌體量過多，無法用專用tip吸走。請使用9 O.D.以下的菌體。

2.使用手動操作的場合

(1) plasmid DNA的回收量少

原因對策

磁珠Ⅱ的使用量過少請使用磁珠Ⅱ的規定劑量。

吸附液的使用量過少請使用吸附液的規定劑量。

用70%以下濃度的乙醇溶液清洗磁珠，或者清洗時間過長請用70%乙醇溶液洗凈。清洗請不要超過1min。

溶出液過少請使用50μl以上的溶出液。

Plasmid DNA的拷貝數過少使用手動法的情況下，請增加抽提規模。菌體量，試劑的使用量可以增加至2倍。不過溶出液也會因此而增加，故回收濃度不會上升。

(2)Plasmid DNA純度差

原因對策

菌體的溶解，殘渣的凝聚工序不能正常進行請使用規定的溶解工序時間及溶解液劑量。此工序下的純度如果偏低，吸附·洗凈時的磁珠就會難以分散，回收液的純度也會因此變差。

用70%以上濃度的乙醇溶液來清洗磁珠，或者洗凈時間過短。請用70%乙醇溶液清洗，直至磁珠完全分散(1min)。