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  • 奧運促紅細胞生成素(EPO)的血液檢測方法

    上一篇 / 下一篇  2008-08-18 18:53:01

    ◎ 周 剛

    摘 要:重組人促紅細胞生成素(rHuEPO)被禁止用于提高運動員的成績,但是用常規的檢測方法很難區分內源性EPO和外源性EPO。運動員使用EPO后,會導致其一些血液參數的變化,通過對這些血液參數的檢測,可以間接判定運動員是否使用了EPO。本文綜述促紅細胞生成素的血液檢測方法的研究進展,明確指明了 EPO血液檢測的原理和方法,并重點討論了轉鐵蛋白受體和網織紅細胞參數等指標的檢測原理和方法,以及悉尼奧運會的EPO血檢方法。

    關鍵詞:促紅細胞生成素,重組人促紅細胞生成素,血檢。

    1.EPO和rHuEPO

    增加紅細胞量對于提高運動成績的好處已被廣泛的報導。就目前而言,增加血紅細胞量的途徑主要有:1.持續的艱苦訓練或高原訓練;2.采用血液回輸技術;3.注射促紅細胞生成素。

    毫無疑問,即使在高水平運動員中,靠持續的艱苦訓練或高原訓練,要大幅度地提高自身固有的血液濃度和血紅蛋白含量是很困難的。于是,有人便另辟"捷徑",企圖通過采用不正當手段來實現上述目的。二十世紀七十年代,一些長跑運動員曾在慕尼黑(1972)和蒙特利爾(1976)兩屆運動會上利用自體輸血的技術參加比賽,有的運動員還取得了金牌 [1]。隨著檢測技術的發展,用常規的尿檢方法已能很容易地檢測出血液興奮劑的濫用,于是,一些運動員便轉向使用其它尿檢不易查出的興奮劑,這其中便包括 EPO[2]。而今,促紅細胞生成素已成為目前國際體壇"最具欺騙性的藥物"。

    人體的腎臟能產生一種紅細胞生成酶(erythrogenin),這種酶作用于肝臟所產生的促紅細胞生成素的前身(一種α-球蛋白)促紅細胞生成原(erythropoietinogen),它們在血漿中轉變成人促紅細胞生成素(Erythropoietin,EPO)[3]。最近發現,肝細胞和巨噬細胞也能產生EPO。EPO屬酸性糖蛋白,它與紅細胞前體細胞表面EPO受體結合,促進其血紅蛋白的合成,使之增殖分化成紅細胞,從而調節體內紅細胞和血紅蛋白的生理平衡。它的表達有其嚴格的組織特異性,同時嚴格受體內氧分壓的控制。正常情況下人血液中EPO水平保持在4×10-3~24 ×10-3U/mL,再生障礙性貧血患者因組織嚴重缺氧,血液中EPO水平可高達10U/mL[4]。

    早年從再生障礙性貧血病人的尿中、胎腎細胞的培養液中可獲得較多的EPO。1985年應用基因重組技術,獲得重組人EPO (Recombinant Human Erythropoietin,rHuEPO),有了大量純品EPO的問世,使EPO得以在臨床上廣泛應用[5,6]。rHuEPO與 EPO的作用極為相似,可以明顯提高人體的紅細胞數量及血紅蛋白含量,從而提高人體運輸氧的能力,提高人體最大攝氧量。在使用rHuEPO4-7天后, rHuEPO已恢復正常水平,應用常規檢測的色譜學方法無法查出,而其功效還可持續四周之久,這正是有氧耐力運動員所期望的。因此,在2 0世紀80年代,人工合成的rHuEPO開始被用作體育訓練及競賽中的輔助藥物,個別人為了追求良好的訓練及比賽成績并逃避藥檢,越來越多地服用此類藥物,rHuEPO也被直接稱為EPO。然而,rHuEPO的濫用可導致血小板功能亢進、高血壓、中風等疾病,嚴重者甚至死亡。有鑒于此,1989年國際奧委會醫學委員會將EPO等4種人工合成的肽類激素正式列為禁用藥物。

    2.rHuEPO的血液檢測原理

    由于檢測技術的原因,EPO在體能類運動項目中的濫用一直無法進行有效的控制。有三個方面的因素限制了EPO的檢測,這些因素是:其一, rHuEPO與內源性EPO的分子結構極為相似。EPO是一種含有166個氨基酸的單鏈酸性糖蛋白,分子量為34000D(道爾頓),而 rHuEPO的分子量為30400D,也是單鏈糖蛋白[7]。現在還沒有技術能從統計學上鑒別、分離和確定rHuEPO的數量[8];其二,rHuEPO 與內源性EPO相似的臨床效果。其功能都是刺激造血祖細胞分化為紅細胞;其三,rHuEPO的平均半衰期大約為6小時,大多數rHuEPO在1-3天內被身體清除,然而其功效仍可以持續四周[9,10]。因此,按常規的尿檢或血檢方法很難直接檢測出rHuEPO的存在,更少有機會通過血清的EPO水平檢測出濫用者,尤其是在競賽期間。

    研究表明,在停止注射EPO四周后,體內EPO恢復到正常水平,甚至低于正常水平[9,10,]。這就是說,為了保持其有效性,興奮劑使用者不得不在賽前四周內注射rHuEPO,而最佳的使用效果是在賽前兩周內注射。這就給興奮劑檢測者提供了一個檢測出當前或最近使用了rHuEPO的運動員的機會。

    從這個思路入手,一些研究表明:rHuEPO的使用不可避免地會導致血液中一些生理生化指標的改變,這些指標包括可溶性轉鐵蛋白受體(soluble transferrin Receptor, sTfr )和與血紅細胞及網織紅細胞相關的各種參數,如紅細胞壓積(hematocrit ,Hct),血紅蛋白含量(Haemoqlobin,Hb)和網織紅細胞計數(reticulocyte count, #retic)等等[2,8,11,12,13,14]。依賴于對這些間接指標的檢測,與沒有用rHuEPO的正常人的指標相比較,可用于查明運動員當前或近期濫用rHuEPO,這是目前EPO檢測的一個現實思路。

    國際自行車聯合會曾以紅細胞壓積(Hct)超過50%為界線來判定使用了EPO[15],而國際業余滑冰組織則以血紅蛋白(Hb)超過 18.5g×dL-1來判定明顯地使用了EPO。然而,Hct 和Hb是相當粗糙的血液特征檢測指標。血液特征受脫水,心情和運動方式的影響,并且50%的限制不排除個別優秀運動員有自然的高Hct。

    早期的研究還有檢測濫用rHuEPO的間接指標Tfr[14,16,17]。一項最近的研究指出,在最后一次使用rHuEPO后的25 天內,Tfr還高于正常水平。一項運動員使用rHuEPO的藥動學研究表明,盡管用藥后4到7天內EPO已回落到正常水平,但直到用藥后第14天,許多血液學指標還高于正常水平[11]。

    另外,最近的幾項關于rHuEPO的研究報道,網織紅細胞絕對計數(#retic),每個網織紅細胞的血紅蛋白含量(CHr),網織紅細胞的血紅蛋白總量(RetHb),血紅細胞的血紅蛋白與網織紅細胞的血紅蛋白的比率(RBCHb:RetHb)等指標也可做為檢測rHuEPO的間接指標[8,10,11]。國內外現在已有大量關于EPO檢測方法的報道,下面重點對EPO的血液檢測方法做一綜述。

    3.rHuEPO的血液檢測方法

    3.1轉鐵蛋白受體(Transferrin Receptor, Tfr)

    Tfr為一雙糖蛋白,分子量為2×94000D,實際上存在于所有細胞的表面上。但成人中,約有80%存在于骨髓成紅細胞中。當紅細胞受到EPO的刺激時,Tfr會將與其結合的血液中富含的轉鐵蛋白中的鐵轉移到血紅蛋白的卟啉中。隨著紅細胞的成熟,Tfr及Tfr的一些碎片將被釋放進入血液循環。因此,以免疫方法定量測定血中的Tfr及其碎片可以提供一個可能的方法以檢測外源EPO的使用。國內外許多相關的實驗都證實了Tfr作為檢測 rHuEPO的間接指標的可靠性[11,13,14,17]。以下是一些這方面的實例。

    加拿大的Gareau等人報道:以50~100IU/kg.bw的EPO進行每周三次的皮下注射后,以酶聯免疫吸附法(ELISA)測定給藥組(n=24)血清中的Tfr的濃度為3135±312ng/mL, 而對照組(n=6)的血清濃度為2195±225ng/mL(P<0.001)[16]。在Gareau等人的另一項實驗中也得出同樣結果, rHuEPO的濫用導致Tfr的延遲性增加和fr(鐵蛋白)的延遲性減少,Tfr/fr升高。作者提出,可用Tfr和Tfr/fr作為檢測運動員濫用 rHuEPO的指標[14]。

    方子龍等給6名健康青年男性受試者皮下注射rHuEPO,劑量為30IU/kg體重,每周3次,持續4周,采用ELISA進行指標測定。結果表明,注射rHuEPO能提高血清EPO濃度和轉鐵蛋白可溶性受體Tfr的濃度;在停藥后1個星期左右的時間內,Tfr濃度仍保持在較高水平。結果提示:血清EPO和Tfr濃度有可能作為rHuEPO檢測的指標[18]。

    法國的Audran等人也做了相關的實驗:給9名運動員每人每天皮下注射50IU/kg的rHuEPO,持續26天。分別于用藥期 10,14,17,24天和用藥后1,3,7,14,25天抽取血樣分析。結果表明,rHuEPO的濫用,使運動員的有氧能力明顯提高,同時,用藥期間及停藥兩周內Tfr和Tfr/fr均顯著升高。作者提出,以Tfr高于10μg/mL 和Tfr/fr高于153,來判定是否使用了rHuEPO[11]。

    多年來,國外在Tfr的檢測方面已做了大量的研究,可以肯定的是,Tfr已成為目前EPO檢測中最為可靠,最為常用的指標。

    3.2網織紅細胞參數

    網織紅細胞(reticulocyte)是介于晚幼紅細胞和成熟紅細胞之間尚未完全成熟的紅細胞。因其胞質內尚存留多少不等的嗜堿物質 RNA,經煌焦油藍、新亞甲藍等活體染色法染色后,嗜堿物質凝聚成顆粒,其顆粒又可聯綴成線,而構成網織狀,此種紅細胞即網織紅細胞 [19]。濫用rHuEPO將導致血液中的網織紅細胞的參數變化。這些參數包括網織紅細胞絕對計數(#retic),每個網織紅細胞的血紅蛋白含量(CHr),網織紅細胞的血紅蛋白總量(RetHb),血紅細胞的血紅蛋白與網織紅細胞的血紅蛋白的比率(RBCHb:RetHb)[8,11]。

    澳大利亞的Parisotto等人對此進行了深入的研究。在一項實驗中[8],他們以自行車、游泳、賽艇、田徑和越野滑雪等項目的國家級和世界級運動員(n=155)為對照組,對照組又分為模擬高原訓練組和高原訓練組;以健康的非運動員男性(n=23)為實驗組,實驗組又分為三組,A組在1、4、7、10天每天注射300U/kg rHuEPO,B組在1、5、9天每天注射400U/kg rHuEPO,C組在1、10天每天注射600U/kg rHuEPO。在第11天采樣,采用流量血細胞計數法進行分析。實驗結果顯示:注射rHuEPO的非運動員的網織紅細胞參數明顯地不同于正常訓練的優秀運動員的,也不同于在高原或模擬高原訓練的運動員的。注射rHuEPO的非運動員的#retic增加近三倍(注射rHuEPO前后的#retic 分別為25-53×109/L和193-260×109/L),RetHb增加近兩倍,同時,RBCHb:RetHb明顯降低。作者認為,最好的檢測rHuEPO的指標是#retic,其次是RetHb和RBCHb:RetHb。據此檢測的失誤率在10000例被試中不超過7例(95%置信區間)。作者建議可用網織紅細胞參數(#retic,RetHb,RBCHb:RetHb)作為檢測優秀運動員當前或最近濫用rHuEPO的間接指標。另外,這項實驗同時也說明了高原訓練和模擬高原訓練不影響這些指標的可靠性。

    上述Audran等人的實驗也檢測到,從注射rHuEPO到停止使用rHuEPO的25天內,網織紅細胞參數都發生顯著性變化(P<0.01)[11]。

    3.3悉尼奧運會的EPO血檢方法

    1999年澳大利亞體育學院(AIS)成立了"EPO2000"科研攻關組,并協同澳大利亞體育運動興奮劑檢測實驗室(ASDTL)聯合進行一項注射EPO的課題,該課題后來被命名為"EPO2000"研究計劃[22]。這項研究課題后來又有許多國家和地區的專家共同參與攻關(包括澳大利亞、法國、加拿大、挪威和中國),上述研究者Parisotto,Gareau,Audran等都參與了該計劃。

    國際奧委會執委會在2000年8月28日正式通過了在悉尼奧運會上采用"EPO2000"研究的EPO血檢和尿檢方法的決定。其中澳大利亞科學家的血檢研究成果意義更加重大,因為這是奧運會歷史上引進的第一項血檢技術,它突破了尿檢技術只有在服用EPO后三天內檢測才有效的局限性(尿檢方法為法國科學家研究成功)。

    澳大利亞體育學院Parisotto等人2000年發表在血液學雜志上的實驗報告[20]成為國際奧委會最終同意在悉尼奧運會進行血檢的重要參考性文獻 [22]。該實驗將27名運動員分為三組:EPO+IM組(n=10),注射rHuEPO和鐵;EPO+OR組(n=8),注射rHuEPO和口服鐵;安慰劑組(n=9)。用藥期為三周,每組被試在用藥期和用藥后四周內的血液學和生化指標被檢測。實驗者從檢測的眾多指標中篩選出5個指標,它們是:Hct, 網織紅細胞壓積(reticulocyte hematocrit, RetHct), 巨紅細胞百分比(percent macrocytes, %Macro),血清EPO和sTfr。實驗設計了兩種分析模型: ON-model和OFF-model。ON-model應用于rHuEPO使用期,在rHuEPO使用期的最后兩周,通過綜合分析上述五個指標,能夠檢測出94-100%的rHuEPO使用者;OFF-model應用于停藥后,綜合分析RetHct,EPO和Hct,在停藥后的12-21天,能夠檢測出 67-72%的rHuEPO使用者。由此證明,這五項指標可用于檢測當前或最近濫用rHuEPO的運動員。

    澳大利亞和中國合作也做了相關的實驗。在這項實驗中,Parisotto等人在悉尼和北京兩地分別對49名和24名運動員進行了EPO 實驗。每名被試每天被注射50 IU/kg rHuEPO,持續25天。結果顯示,兩地被試血液中的上述五項指標在注射rHuEPO期間及注射后4周內均有異常變化。作者認為,通過檢測這五項指標,完全可以準確地查出數周內濫用rHuEPO的運動員[21]。該實驗的另一意義在于補充了黃種人(人種)和中國人(民族)的EPO檢測數據。

    綜上所述,采用檢測rHuEPO導致的血液中一些"間接指標"的變化來判定優秀運動員當前或最近濫用rHuEPO是行之有效的方法,尤其是綜合多項指標來進行分析,并結合尿檢時,對于數周內使用rHuEPO者的檢測,其準確率幾近100%。然而,盡管檢測EPO的方法已日臻完善,但對于高原訓練與內源EPO的產生,不同地域和不同人種紅細胞數量的不同等方面研究成果還相對缺乏,這限制了EPO血檢技術的應用,這也是悉尼奧運會最終采用尿檢與血檢共同使用,而不單以血檢結果判定濫用rHuEPO的原因之一。如何解決這些難題,使EPO的檢測方法準確而無隙可擊將是興奮劑檢測工作者進一步研究的課題。

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    22. 澳大利亞體育運動興奮劑檢測實驗室(ASDTL).EPO2000. www.agal.gov.au/ASDTL/epo.html

    作者簡介:周剛,重慶市人,1967年生,華東師范大學體育與健康學院運動科學專業2003級博士生,導師許豪文教授。


    TAG: epo檢測方法血液

    小熊貓 引用 刪除 LFW369369   /   2008-11-03 11:44:48
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