蛋白質組學研究的技術體系

蛋白質組學的發展和其技術的發展是緊密聯系并相互作用的，一方面蛋白質組學的發展依靠技術進步的推動，另一方面蛋白質組學研究本身反過來又促進了技術的突破。這些支撐蛋白質組學發展的技術除了包括在蛋白質組學產生以前就出現了的雙向凝膠電泳和生物質譜技術以外，也包括蛋白質組學發展過程中出現的一系列定量技術和數據分析方法。到目前為止，蛋白質組學技術已經成為一個完整的系統，主要分為四大類。第一類是凝膠和非凝膠的蛋白質組分離技術；第二類是基于生物質譜技術的蛋白質組學鑒定技術；第三類是蛋白質組學定量技術；第四類是基于生物信息學的蛋白質組學數據的分析處理技術。正是由于建立了如此豐富全面的技術系統，蛋白質組學的研究才能在短短的十幾年間取得飛速發展。下面對蛋白質組學技術及其優缺點予以具體介紹。

     在整個蛋白質組學的研究中，分離技術是最基礎的部分。如何實現對復雜的蛋白質樣品或者其酶解產物進行有效的分離，是對樣品做后續鑒定的先決條件。目前蛋白質組學常用的分離技術主要有兩種類型，一是凝膠技術，主要包括雙向凝膠電泳（Two-dimensional electrophoresis，2-DE）技術以及后來出現的雙向熒光差異凝膠電泳技術（Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis，2D-DIGE）；二是非凝膠技術，主要是色譜(Liquid Chromatography，LC )技術，尤其是高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）和多維液相色譜（Multi-Dimensional Liquid Chromatography，MDLC）。

     傳統的雙向凝膠電泳（Two-dimensional electrophoresis，2-DE）技術由O’Farrell和Klose等人于1975年建立。第一向為等電聚焦（Isoelectrofocusing，IEF），使蛋白質根據等電點不同進行分離，第二向為SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），即將等電聚焦后的膠條放在SDS-PAGE上再根據蛋白質分子量不同進行電泳分離。由于具有高分辨率的特點，雙向凝膠電泳在蛋白質組學的研究當中始終占據著重要的地位。

     現在的雙向凝膠電泳技術第一向利用固相pH梯度（Immobilized pH Gradient，IPG）等電聚焦技術，具有上樣量大、分辨率高、重復性好等優點，并且可以提供蛋白質的等電點（pI）和分子量（MW）數值信息，有助于蛋白質的鑒定，而且雙向凝膠電泳膠上常見的isoform多是蛋白質翻譯后修飾的結果，對于這些蛋白質點的分析有助于了解對蛋白質功能影響重大的翻譯后修飾。但是雙向凝膠電泳技術本身也存在一些難以克服的缺陷，主要表現在兩個方面。第一，雙向凝膠電泳對蛋白質的分離受到蛋白質豐度、等電點、分子量和疏水性等的限制。對于低豐度蛋白質，由于上樣量的限制不能達到足夠質譜鑒定需要的量；對于極大蛋白質(相對分子質量>200 kDa)、極小蛋白質(相對分子質量<8 kDa)、極堿性蛋白質和疏水性蛋白質(膜結合蛋白質和跨膜蛋白質)，都難以進行有效分離分析。第二，雙向凝膠電泳操作費時費力，難以實現和質譜的直接聯用，不易自動化。

 

     目前在傳統雙向電泳技術的基礎上發展出的雙向熒光差異凝膠電泳(Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis, 2D-DIGE) (圖1)，采用專有的熒光染料與多重樣本和圖象分析的方法,在同一塊膠上可同時分離多個由不同熒光標記的樣品，并以熒光標記的樣品混合物為內標，對每個蛋白質點和每個差異都可以進行統計學可信度分析，從而具有良好的重復性和較高的準確率。另外，由于熒光染料的使用，使得雙向熒光差異凝膠電泳具有高靈敏度的特性，能夠滿足高通量差異蛋白質組學研究分析的要求。

     雙向凝膠電泳作為蛋白質組學最經典的技術手段，隨著本身的的不斷發展，染色技術的突破，樣品制備方案的改進，還將在蛋白質組學研究中繼續發揮作用。

     色譜技術是目前蛋白質組學最常用的分離技術，尤其是色譜技術可以實現與質譜的自動化聯用，對于蛋白質組學研究有重大意義。除了自動化后節省大量的工作外，其意義之一就是對于實驗樣品蛋白質量很少時的，可以直接進行shotgun分析，而不再依賴于雙向凝膠電泳。

     對于蛋白質組學有重大意義的色譜分離技術是多維液相色譜技術，這種分離方法與串聯質譜聯用的2D-LC-MS/MS可以檢測動態范圍10000:1內的低豐度肽段，是目前蛋白質組學研究最主要的技術路線，已發展成自動化系統，可快速、高通量鑒定復雜蛋白質混合物。在蛋白質組學研究的多維液相色譜技術中，最常用的是離子交換色譜－反相液相色譜的聯用。離子交換色譜是通過溶質在離子交換色譜固定相上具有不同的保留能力而實現樣品分離的色譜技術，而反相液相色譜是基于溶質疏水性的差異而實現分離的色譜技術。通過這兩種色譜模式的聯用，可以實現對復雜生物樣品的二維分離。

1999年，Yates研究組提出并建立了多維蛋白質鑒定技術(Multidimensional protein identification technology，MudPIT) (圖2)，這種技術是將不同分離模式的色譜柱以串聯方式合并于同一根色譜柱中進行。Yates等在同一根色譜柱的前半部分裝填強陽離子色譜填料，后部分裝填反相液相色譜填料。該方法可對樣品量較少的蛋白質進行快速分析，適用并且已經成功應用于蛋白質組學中大規模蛋白質的分離鑒定。在對蛋白質組進行定性分析的同時，MudPIT技術也被Washburn等成功應用于定量蛋白質組學研究。然而在強陽離子交換柱上一般使用鹽梯度進行肽段復合物的分級，由于過多的鹽類與質譜是不兼容的，因而常常需要offline的除鹽過程或需要在上樣后經過多個柱體積的洗滌以保證質譜分析。2005年，我們實驗室發明了一種新型的2D-LC技術，液相分離仍然使用強陽離子交換柱和反相柱，但在強陽離子交換柱上采用9個不同的pH梯度(pH 3、 pH 3.5、pH 4、 pH 4.5、pH 5、 pH 5.5、pH6、 pH 7、pH8)代替鹽梯度分級肽段混合物，再進行反相的分離。這一方法避免了在HPLC系統中引入過多鹽類，從而實現了多維液相色譜與串聯質譜的直接連接。應用這一強大的新型2D-LC肽段分離手段結合串聯質譜技術，在一次實驗中就有2000種以上的小鼠肝組織蛋白質得到鑒定。

     在蛋白質組學研究流程中，蛋白質鑒定技術是最關鍵的部分。在蛋白質組分離技術方面還有凝膠電泳技術和色譜技術的選擇，而蛋白質鑒定技術方面卻只是生物質譜技術（Bio-Mass Spectrometry）一枝獨秀。質譜技術在二十世紀初就已出現，但一直僅應用于有機小分子領域，直到八十年代才漸漸應用到生物大分子領域。經過二十多年來的應用和發展，質譜技術已是蛋白質組研究中必不可少的工具，并成為蛋白質組研究中的主要支撐技術。

質譜技術的基本原理是使樣品分子離子化后，根據不同離子間的質荷比（m/z）的差異來分離并確定相對分子質量。一臺質譜儀一般有進樣裝置、離子化源、質量分析器、離子檢測器和數據分析系統組成。在這幾部分中，離子化源和質量分析器是兩個核心部件，也是發展得最快的兩個方面。根據離子化源的不同，質譜主要可以分為電噴霧電離質譜（Electrospray Ionization Mass Spectrometry，ESI-MS）和基質輔助激光解析電離質譜（Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry，MALDI-MS）兩大類。

     所謂電噴霧電離質譜就是以電噴霧離子化（ElectroSpray Ionization，ESI）為電離方式的質譜。電噴霧離子化是一種“軟電離”方式，它是在“離子蒸發”原理上發展起來的一種離子化方法。離子蒸發是指離子從液相發射到氣相的過程。待測分子溶解在溶劑中，以液相方式通過毛細管到達噴口。在噴口高電壓作用下形成帶電荷的微滴，隨著微滴中的揮發性溶劑蒸發，微滴表面的電場隨半徑減少而增加，到達某一臨界點時，樣品將以離子方式從液滴表面蒸發，進入氣相。這一過程即實現了樣品的離子化，沒有直接的外界能量作用于分子，因此對分子結構破壞較少，是一種典型的“軟電離”方式。

     電噴霧質譜的另一大特點是可形成多電荷離子，因此在較小的m/z范圍內可以檢測到大分子質量的分子。采用電噴霧質譜目前可測定分子質量100 kDa以下的蛋白質，最高可達150 kDa。由于離子蒸發使電噴霧質譜采用液相方式進樣，因此可與蛋白質化學中常用的液相色譜聯用，即液相色譜-電噴霧質譜(LC-ESI MS)，蛋白質或多肽經過高效液相色譜分離后，直接進入質譜進行分子質量測定。

     在常規電噴霧質譜中，噴霧的過程易形成較大液滴，液滴中的樣品分子在離子源就不能完全離子化，從而降低了樣品的利用率和靈敏度。近年發展的納升電噴霧技術 (nanospray-ESI，nano-ESI)有效的解決了這一問題，使樣品被充分利用，并有效離子化。

     基質輔助激光解析電離質譜（MALDI-MS）是利用固體基質分子均勻的包埋樣品分子，在激光的照射下，基質分子吸收激光能量而蒸發，攜帶樣品分子進入氣相，進一步將能量傳遞給樣品分子，從而實現樣品分子離子化。由于樣品的電離過程是由基質介導的，因此基質的選擇對分子離子化有很大的影響, 繼而影響到分析的靈敏度、分辨率和精確度。合適的基質應該是保證待測物的離子化，而且基質本身的離子造成的背景較弱。蛋白質和多肽樣品較為通用的基質有芥子酸(Sinapinic Acid，SA)、a-氰基-4-羥基肉桂酸(a-cyano-4-hydroxycinnamic acid，CHCA) 和2，5-二羥基苯甲酸( 2, 5-dihydroxybenzoic acid，DHB)。MALDI 最大的特點是離子電荷通常為1-2個，而不象ESI中為多電荷離子，對分子質量較大的樣品而言，不會形成復雜的多電荷圖譜，因而對圖譜的解析比較清楚。

     串聯質譜在解析蛋白質或者肽段序列信息以及蛋白質磷酸化位點等方面具有無法替代的作用，這里專門予以介紹。

     串聯質譜（tandem MS，MS/MS）是指多個質量分析器相連，分離母離子，進行碰撞解離，并檢測子離子。MS/MS較早在四極桿質譜中實現：將三個四極桿串聯，第一個四極桿進行母離子分析，選擇感興趣的離子進入第二個四極桿，與惰性氣體碰撞成碎片后，進入第三個四極桿進行子離子分析（圖3）。

     與串聯質譜平行的一個概念是碰撞誘導解離（Collision Induced Dissociation，CID）。在串聯質譜誕生以前，為獲得分子結構信息，需要在離子源內（in-source）對離子進行碰撞，使其碎裂。源內CID靈敏度高，但沒有選擇性，因此碎片的專一性不強。串聯質譜出現后，逐漸取代了源內CID。嚴格地說，CID僅指離子解離成碎片的過程，串聯質譜則包括了母離子選擇、CID和子離子分析三個過程。

     最新發展應當是2005年由熱電公司推出的靜電場軌道阱（Orbitrap）質譜，是20年來離子阱質譜技術的重大突破。Orbitrap是一種離子阱，但是它不同于傳統的離子阱，它既沒有射頻電場也沒有磁體產生的磁場來捕獲離子。進入Orbitrap的離子是由里面的靜電場來捕獲的。該質譜儀的質量分辨率可以和離子回旋共振質譜相媲美，為小分子研究、藥物開發、蛋白質組學、代謝物鑒定等提供了更出眾的性能，而且體積較小，價格相對便宜。

     蛋白質組學的研究目的是以大規模的尺度研究細胞內蛋白質的功能，這種研究要走向成熟必然要脫離對蛋白質的簡單鑒定，實現對蛋白質的表達水平及其變化的檢測。因此，定量技術應該說是整個蛋白質組學的精華部分。而這種定量通常不必是檢測蛋白質在細胞內的絕對含量，而只需對其相對含量進行定量即可。

     目前，蛋白質組研究中應用的比較成熟和可信的定量策略和方法主要有兩種。一種是基于傳統雙向凝膠電泳及染色基礎上的定量，另外一種是基于質譜檢測技術的定量。

     建立在傳統的雙向凝膠電泳和染色基礎上的定量方法，通過比較不同膠上蛋白質點的染色強度來進行相對定量。現有的染色方法包括銀染、考馬斯亮藍染色，還有最新的熒光燃料。染色在顯示蛋白質的存在的同時，還提供了其表達水平的信息。

     這類定量方法面臨三個方面的問題。第一，用這類方法準確定量和實現高通量的關鍵是找到靈敏度高、檢測動態線性范圍大的染料。傳統的考馬斯藍染色和銀染已經不能滿足準確定量的需求，現在發展了不少新的熒光染料染色技術。例如SYPRO Ruby等發光金屬螯合熒光染料和雙向熒光差異凝膠電泳技術采用的Cy2、Cy3和Cy5熒光燃料都具有靈敏度高，檢測動態范圍大的優勢；第二個問題是前面已經提到的，由于雙向凝膠電泳本身的限制，這類定量方法不能有效檢測出具有極端等電點的、分子質量太大和太小的蛋白質以及低豐度的蛋白質和膜蛋白；第三個問題是雙向凝膠電泳不能對蛋白質實現絕對分離，許多單一的蛋白質點包含了一個以上的蛋白質，對這樣的蛋白質點的定量也就比較牽強。

    但是基于凝膠的定量特別是DIGE技術，采用了完善的統計學分析手段，使定量結果準確性有很大保證。

    基于質譜的蛋白質組學定量技術的基礎在于肽段豐度可以用質譜峰的信號強度來表現，它可以分為兩大類：第一類為標記定量技術（Labeling quantitation），第二類則為非標記定量技術（Label-free quantitation），而前者則可更細分為體內標記（in vivo labeling）定量技術和體外標記（in vitro labeling）定量技術。定量蛋白質組學技術后面有專門的介紹，這里簡單帶過。

     蛋白質組學本身是一門大科學，其產生的數據量是十分龐大。如何將大量的蛋白質組學數據進行儲存和加工，使之轉變成可以理解的具有生物學意義的結果比如蛋白質名稱，多肽序列，蛋白質結構，蛋白質差異等；如何使蛋白質組學的研究流程盡可能的符合高通量、自動化的要求；如何深入的挖掘蛋白質組學數據內隱藏的生物學規律，比如蛋白質的亞細胞定位、蛋白質的翻譯后修飾序列和位點信息、跨膜序列分析和信號肽序列分析等已經成為蛋白質組學面臨的重要問題。而這些問題的解決必須要依賴于生物信息學分析手段。生物信息學（bioinformatics）是在生命科學、計算機科學和數學分析的基礎上逐步發展而形成的一門新興交叉學科，是運用數學與計算機科學手段進行生物數據等信息的收集、加工、存儲、分析與解析的科學。隨著蛋白質組學的不斷發展，也對生物信息學提出了更多的挑戰，兩者不斷的相互作用形成了蛋白質組生物信息學這一活躍的研究分支。