T/CI 011-2021
細菌生物被膜的培養、觀測和耐藥性評測技術指南

Technical guidelines for the cultivation, observation and drug resistance evaluation of bacterial biofilm

被代替

標準號

T/CI 011-2021

發布

2021年

發布單位

中國團體標準

替代標準

T/CI 011-2022

當前最新

T/CI 011-2023

 

 

適用范圍

細菌生物被膜培養方法與技術標準 以下生物被膜培養方法與技術標準均以銅綠假單胞菌為模式菌株撰寫，其他菌種培養以及實驗條件可按需求適當調整。 銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一種常見的革蘭氏陰性條件致病菌，在正常人皮膚、呼吸道、腸道以及多種自然環境如水、土壤中廣泛分布。此菌為桿狀單鞭毛形態，適宜生長溫度為25-37℃，在42℃也可生長，于LB培養基上呈青綠色圓形菌落且極易附著在不同基質表面形成生物被膜。銅綠假單胞菌是醫院內感染的主要致病菌之一，可在免疫力低下的患者不同部位形成生物被膜引起長期慢性感染，包括燒傷傷口感染、呼吸道感染和尿路感染等，并可引發菌血癥和敗血癥等致命并發癥。此菌對多種抗生素耐藥，并且耐藥機制非常復雜，包括形成生物被膜、加強外排泵系統、改變細胞膜通透性與藥物作用靶點、以及分泌抗菌酶等。銅綠假單胞菌生物被膜的形成機制也相當復雜，例如通過過量分泌胞外多糖、積累胞外DNA、降低運動能力、調節群體感應系統等。作為研究生物被膜的模式菌株，銅綠假單胞菌早已被廣泛應用于構建生物被膜、檢測其耐藥性并開發用藥方案的研究中，是以本指南以銅綠假單胞菌為模式菌株撰寫，其他菌種的培養及實驗條件可按需適當調整以達到最佳實驗結果。 4.1 體外靜態生物被膜培養  本指南囊括四種常用的體外靜態生物被膜培養方法，包括孔板培養法、玻璃珠培養法、玻片培養法和Peg-lid培養法。 （1）孔板培養法（4.1.1）將稀釋菌液在96孔板或24孔板中培養，生物被膜附著于孔壁上，移除懸浮液并洗脫浮游菌體可得到生物被膜用于后續實驗。孔板培養法一般用于檢測菌種生物被膜形成能力、生物被膜定量、生物被膜耐藥性和藥物最小抑菌濃度等實驗。此培養法可與多種染色法結合用于定量生物被膜，培養出的生物被膜結構可用不同顯微鏡觀察。此培養法具有通量高、培養時間短和操作簡單等優勢，但培養的生物被膜厚度與硬度較低，浮游菌體不易洗脫造成平行間差異較大。 （2）玻璃珠培養法（4.1.2）在24孔板中將玻璃珠置于稀釋菌液內培養，生物被膜附著于玻璃珠表面，洗脫浮游菌體可得到生物被膜用于后續實驗。此培養法與孔板培養法類似，一般用于檢測菌種生物被膜形成能力、生物被膜定量、生物被膜耐藥性和藥物最小抑菌濃度等試驗。此培養法可與多種染色法結合用于定量生物被膜，但不易在顯微鏡下觀察。此培養法具有通量高、培養時間短等優勢，但操作略復雜。此方法培養的生物被膜厚度與硬度較高，浮游菌體較易清洗，平行間差異較小。 （3）玻片培養法（4.1.3）將玻片插入菌液培養，生物被膜附著于玻片表面，去除撥片并洗脫浮游菌體得到生物被膜用于后續實驗。此方法一般用于檢測菌種生物被膜形成能力、觀察生物被膜結構與形態，可與多種染色方法和多種顯微鏡結合使用觀測生物被膜構態。此方法通量高、培養時間短，但操作略復雜。此方法培養的生物被膜量較大、厚度與硬度高，浮游菌體易清洗，平行間差異較小。 （4）Peg-lid培養法（4.1.4）將帶有凸起楔子（peg）的96孔板蓋置于裝有菌液的96孔板中培養，生物被膜附著于peg中下端，取下蓋子并洗脫peg上的浮游菌體可得到生物被膜用于后續實驗。此方法與孔板培養法類似，一般用于檢測菌種生物被膜形成能力、生物被膜定量、生物被膜耐藥性和藥物最小抑菌濃度等試驗。此培養法可與多種染色法結合用于定量生物被膜，但培養出的生物被膜由于在楔子頂端，不易于顯微鏡觀察。此培養法具有通量高、培養時間短和操作簡單等優勢，培養的生物被膜厚度與硬度較高，浮游菌體較易洗脫、平行間差異較小。 每種培養與觀測方法細節請見下文。 4.1.1 孔板培養法 適用范圍：孔板生物被膜培養法通常適用于以下場景：（1）需要檢測不同菌種（野生菌種和突變菌種）間生物被膜形成能力，（2）需要檢測不同菌株在生物被膜狀態下對藥物的敏感/耐受性。針對孔板培養的生物被膜的分析方法主要包括：生物被膜定量（章節5.1.2a）、生物被膜耐藥性和藥物最小抑菌濃度（章節6.1）。以下示意裝置和操作均以銅綠假單胞菌（PA）為模式菌株，在耗氧培養條件下進行示例：   圖1. 體外靜態生物被膜培養方法（孔板培養法） 4.1.1.1 實驗材料： a. 無菌96孔板（或24孔板, Nest/Corning）； b. 無菌儲液器； c. 100 μL排槍移液器（或1 mL移液器）； d. 15 mL無菌搖菌管； e. 100 μL（或1 mL）移液器槍頭； f. LB培養基（可按需使用其他培養基）； g. 所需菌株； h. 廢液桶； i. 75%酒精； j. 無菌ddH2O； k. 無菌生理鹽水。 4.1.1.2 培養步驟【附錄以protocol/SOP模式進行詳細闡述】 首先將目標菌株接種至LB培養基中培養過夜。在無菌操作臺中，用新鮮培養基將菌液按一定比例稀釋，隨后將稀釋好的菌液傾倒入無菌儲液器，再用排槍移液器將稀釋菌液加入96孔板或24孔板孔洞中，并置于所需溫度下靜置培養生物被膜。實驗菌種和對照菌種均按照附錄Xa的培養步驟進行接種、培養（附錄Xa），隨后對生物被膜進行分析（章節5）。 4.1.1.3 技術要點 a. 所有操作須嚴格遵守無菌操作流程，在操作過程中注意須使用滅菌器具并用酒精消毒操作臺以及所使用的器具，避免交叉污染； b. 在將菌液加入孔板前，輕輕搖晃儲液器將菌液混合均勻，并用排槍反復輕輕吹打菌液，以減小實驗誤差； c. 孔板培養生物被膜需保證培養后孔洞內剩余菌液體積基本一致，培養時需用透氣封口膜密封孔板防止液體蒸發； d. 移除廢液以及清洗生物被膜時須注意不可用槍頭觸碰生物被膜，以保證生物被膜完整性。 4.1.2玻璃珠培養法 適用范圍：玻璃珠生物被膜培養法通常適用于以下場景：（1）用于循環培養生物被膜進行壓力條件進化實驗，（2）需要檢測不同菌株在生物被膜狀態下對藥物的敏感/耐受性。針對玻璃珠培養的生物被膜的分析方法主要為：CFU計數法（章節5.3.2b）。以下示意裝置和操作均以銅綠假單胞菌（PA）為模式菌株，在耗氧培養條件下進行示例：   圖2. 體外靜態生物被膜培養方法（玻璃珠培養法） 4.1.2.1 實驗材料： a. 無菌24孔板； b. 無菌儲液器； c. 1 mL移液器 d. 15 mL無菌搖菌管； e. 1 mL移液器槍頭； f. LB培養基（可按需使用其他培養基）； g. 無菌ddH2O（可按需使用PBS溶液或生理鹽水）； h. 所需菌株； i. 廢液桶； j. 75%酒精； k. 鑷子； l. 3-5 mm玻璃珠。 4.1.2.2 培養步驟【附錄以protocol/SOP模式進行詳細闡述】 首先將目標菌株接種至LB培養基中培養過夜，用新鮮培養基將菌液按一定比例稀釋，隨后將稀釋好的菌液轉移至24孔板孔洞中，并加入兩顆無菌玻璃珠，37℃ 100 rpm轉速搖晃培養過夜。實驗菌種和對照菌種均按照附錄Xa的培養步驟進行接種、培養（附錄Xb），隨后對生物被膜進行分析（章節5）。 4.1.2.3 技術要點 a. 所有操作須嚴格遵守無菌操作流程，在操作過程中注意須使用滅菌器具并用酒精消毒操作臺以及所使用的器具，避免交叉污染； b. 在將菌液加入孔板前，輕輕搖晃儲液器將菌液混合均勻，并用移液器反復輕輕吹打菌液，以減小實驗誤差； c. 孔洞內菌液不可過多，以免搖晃培養時菌液濺出造成交叉污染； d. 用無菌鑷子轉移玻璃珠時，需盡量減少鑷子與玻璃珠接觸面，以保證生物被膜完整性； e. 孔板培養生物被膜需保證培養后孔洞內剩余菌液體積基本一致，培養時需用透氣封口膜密封孔板防止液體蒸發。 4.1.3 玻片培養法 適用范圍：玻片生物被膜培養法通常適用于以下場景：（1）需要檢測不同菌種（野生菌種和突變菌種）間生物被膜形成能力，（2）需要檢測不同菌株在生物被膜狀態下對藥物的敏感/耐受性。針對玻片培養的生物被膜的分析方法主要包括：生物被膜定量（章節5.1.2c）和生物被膜耐藥性（章節5.3.2c）。以下示意裝置和操作均以銅綠假單胞菌（PA）為模式菌株，在耗氧培養條件下進行示例：   圖3. 體外靜態生物被膜培養方法（玻片培養法） 4.1.3.1 實驗材料： a. 無菌培養皿（靜置培養需準備6孔板）； b. 15 mL無菌搖菌管； c. LB培養基（可按需使用其他培養基）； d. 無菌ddH2O（可按需使用PBS溶液或生理鹽水） e. 所需菌株； f. 廢液桶； g. 75%酒精； h. 鑷子； i. 載玻片。 4.1.3.2 培養步驟【附錄以protocol/SOP模式進行詳細闡述】 首先將目標菌株接種至LB培養基中培養過夜，用新鮮培養基將菌液按一定比例稀釋，隨后將稀釋好的菌液轉移至培養皿，并加入無菌載玻片，37 ℃ 100 rpm轉速搖晃培養過夜。實驗菌種和對照菌種均按照附錄Xa的培養步驟進行接種、培養（附錄Xc），隨后對生物被膜進行分析（章節5）。 4.1.3.3 技術要點 a. 所有操作須嚴格遵守無菌操作流程，在操作過程中注意須使用滅菌器具并用酒精消毒操作臺以及所使用的器具，避免交叉污染； b. 培養皿內菌液不可過多，以免搖晃培養時菌液濺出造成污染； c. 用無菌鑷子轉移載玻片時，需盡量減少鑷子與玻璃珠接觸面，以保證生物被膜完整性； d. 搖晃培養時需用透氣封口膜密封培養皿防止液體蒸發。 4.1.4 Peg-lid 培養法 適用范圍：Peg-lid生物被膜培養法通常適用于以下場景：（1）需要檢測不同菌種（野生菌種和突變菌種）間生物被膜形成能力，（2）需要檢測不同菌株在生物被膜狀態下對藥物的敏感/耐受性。針對Peg-lid培養的生物被膜的分析方法主要包括：生物被膜定量（章節5.1.2c）和生物被膜耐藥性（章節5.3.2c）。以下示意裝置和操作均以銅綠假單胞菌（PA）為模式菌株，在耗氧培養條件下進行示例：   圖4. 體外靜態生物被膜培養方法（peg lid培養法） 4.1.4.1 實驗材料： a. 96孔板； b. Peg lid蓋子（見附錄圖三）; c. 無菌儲液器； d. 100 μL排槍移液器； e. 15 mL無菌搖菌管； f. 100 μL（或1 mL）移液器槍頭； g. LB培養基（可按需使用其他培養基）； h. 所需菌株； i. 廢液桶； j. 75%酒精； k. 無菌ddH2O（可按需使用PBS溶液或生理鹽水）； l. 無菌生理鹽水。 4.1.4.2 培養步驟【附錄以protocol/SOP模式進行詳細闡述】 首先將目標菌株接種至LB培養基中培養過夜，用新鮮培養基將菌液按一定比例稀釋，隨后將稀釋好的菌液轉移至96孔板中，再將peg lid小心蓋入菌液中。37℃ 100 rpm轉速搖晃培養過夜。實驗菌種和對照菌種均按照附錄Xa的培養步驟進行接種、培養（附錄Xd），隨后對生物被膜進行分析（章節5）。 4.1.4.3 技術要點 a. 所有操作須嚴格遵守無菌操作流程，在操作過程中注意須使用滅菌器具并用酒精消毒操作臺以及所使用的器具，避免交叉污染； b. 在將菌液加入孔板前，輕輕搖晃儲液器將菌液混合均勻，并用排槍反復輕輕吹打菌液，以減小實驗誤差； c. 孔洞內菌液不可過多，以免置入peg lid或震蕩培養時菌液濺出造成污染； d. 需保證培養后孔洞內剩余菌液體積基本一致，培養時需用透氣封口膜密封孔板防止液體蒸發； e. 移除廢液以及清洗生物被膜時須注意不可觸碰生物被膜，以保證生物被膜完整性。 4.2 體外動態生物被膜培養  本指南囊括兩種常用的體外靜態生物被膜培養方法，包括管式培養法和池式培養法，詳細介紹如下： （1）管式培養法將菌液注入硅膠管內靜置附著后，將培養基以勻速注入硅膠管，流動培養生物被膜，生物被膜附著于管壁上。此方法一般應用于對生物被膜樣品需求量大的實驗，如生物被膜樣品收集，胞外多糖收集生物轉化（biotransformation）等。此方法可形成大量生物被膜，生物被膜結構厚，通量較高，但培養時間較長，操作較復雜，并不易用顯微鏡觀察生物被膜結構。 （2）池式培養法將菌液注入培養池通道內，翻轉靜置待細菌附著與蓋子上之后，將培養基以勻速注入培養通道，流動培養生物被膜，生物被膜附著于三通道池蓋上。此方法一般應用于生物被膜形態觀察、藥物對生物被膜形態的影響等實驗，此方法形成生物被膜形態與結構完整，可結合有熒光標記的菌株或不同染色法，直接在顯微鏡下觀測生物被膜形態與結構，但通量較低，操作復雜，培養時間較長。 4.2.1 管式培養法（tubing-biofilm） 適用范圍：管式生物被膜培養法通常適用于以下場景：（1）需要模擬管道內生物被膜生長環境的研究，（2）需要相對大量生物被膜樣品的研究，（3）生物被膜對藥物/化合物代謝（biotransformation）的相關研究等。針對管式培養的生物被膜的分析方法主要包括：干重/濕重分析（章節5.4）、基因組/轉錄組/蛋白組提取和測序分析、電子顯微鏡觀察（章節5.7）、氧氣探針/化合物探針監測等。以下示意裝置和操作均以銅綠假單胞菌（PA）為模式菌株，在耗氧培養條件下進行示例： 管式生物被膜培養法具有較高通量，可以一次性培養多通道生物被膜樣品；該方法能夠一次性產出大量生物被膜樣品，常用于干重/濕重分析、基因樣本提取，EPS等代謝產物提取、電子顯微鏡觀察和氧氣探針/化學探針觀察等。   圖5. 體外動態生物被膜培養方法（管式培養法） 4.2.1.1實驗材料： a. 15 mL無菌搖菌管； b. 長50 cm，內直徑1.0 mm 硅膠管（潤澤）； c. 長2520 cm，內直徑 1.0 mm 硅膠泵管（潤澤）； d. 長15 cm，內直徑1.0 mm 硅膠管（潤澤）； e. 長10 cm，內直徑3.2 mm 硅膠管（潤澤）；  f. 長30 cm，內直徑 1.0 mm 硅膠泵管（潤澤）； g. 等徑直通接頭（潤澤）； h. 變徑直通接頭（潤澤）； i. 魯爾接頭（潤澤）； j. 2個2L玻璃培養瓶； k. 10% LB培養基（可按需使用其他培養基）； l. 過濾器（過濾孔0.22 μm）； m. 蠕動泵（aperistaltic pump，MasterFlex）； n. 所需菌株； o. 醫用尖銳物處理容器； p. 75%酒精； q. 鑷子； r. 5 mL及1 mL無菌針管； s. 無菌針頭； t. 移液器； u. 無菌移液管。 4.2.1.2培養步驟【附錄以protocol/SOP模式進行詳細闡述】 首先將裝有培養基的玻璃培養瓶、硅膠管、除泡器和鑷子在121℃高溫高壓滅菌15分鐘，取出并將硅膠管、除泡器和鑷子干燥備用。如圖一所示，在無菌操作臺中按順序用安裝雙向接頭的硅膠管b連接裝有培養基的玻璃培養瓶、無阻泵、過濾器、硅膠管c、d、e、f，2L廢液罐，同個裝置內至少三個平行（圖內展示一個平行），將整個系統置于恒溫培養箱內。 將目標菌株接種至適當體積的LB培養基中，在所需溫度下200 rpm搖晃培養過夜。在無菌操作臺中，用新鮮LB培養基將菌液稀釋至OD600nm=0.1，用無菌針管吸入2 mL稀釋菌液，并將稀釋菌液分別注入硅膠管b平行裝置中，用硅膠封口后靜置培養2小時使細菌細胞粘附于管壁, 用10% LB流動培養基培養3至7天，建立生物被膜。 首先將生物被膜管式培養裝置進行滅菌和組裝，在用藥組的培養基玻璃瓶中加入工作濃度的目標抗生素并混合均勻；在陽性對照組的培養基玻璃瓶中加入已知具有抑菌抑生物被膜濃度的粘菌素colistin并混合均勻；在陰性對照組的培養基玻璃瓶中加入等體積的用藥組抗生素的溶劑并混合均勻。用藥組、陽性對照組和陰性對照組均按照附錄X的培養步驟進行接種、培養（附錄Xe），后收集生物被膜進行觀察。 4.2.1.3技術要點 a. 所有操作須嚴格遵守無菌操作流程，在操作過程中注意須使用滅菌器具并用酒精消毒操作臺以及所使用的器具，避免交叉污染; b. 使用針管與針頭吸取菌液后，針頭不可朝向操作人，不可蓋回針頭蓋子，以免誤傷操作人員； c. 將使用過的針管與針頭丟棄入醫用尖銳物處理容器統一處理，避免誤傷操作人員； d. 保證無阻泵運行速度一致，避免液體回流造成污染； e. 保證硅膠管管壁厚度適宜，造成管壁破裂，影響生物被膜形成； f. 在培養過程中如需添加培養基，須用酒精消毒瓶口與鄰近裝置表面，避免污染； g. 培養瓶口須用透氣封口膜密封防止培養基蒸發。 4.2.2 池式培養法（flow-cell biofilm） 適用范圍：池式生物被膜培養法通常適用于以下場景：（1）需要實時觀察生物被膜形態的相關研究，（2）需要實時觀察生物被膜中標記蛋白/基因表達及分布的相關研究，（3）需要實時觀察生物被膜群落中不同菌種相對位置關系的研究等。針對池式培養的生物被膜的分析方法主要包括：死活菌細胞染色法（章節5.2）、激光共聚焦熒光顯微鏡觀測法（章節5.6）、3D熒光成像定性定量法（章節5.5）等。以下示意裝置和操作均以銅綠假單胞菌（PA）為模式菌株，在耗氧培養條件下進行示例：池式生物被膜培養法通常適用于以下場景：（1）   圖6. 體外動態生物被膜培養方法（池式培養法） 4.2.2.1　實驗材料： a. 15 mL無菌搖菌管； b. 三通道培養池（3-channel flow-cell）與樹脂蓋； c. 蓋玻片； d. 硅膠膠水; e. 長50 cm，內直徑1.0 mm硅膠管； f. 長25 cm長20 cm，內直徑 1.0 mm硅膠泵管，雙端安裝； g. 長15 cm，內直徑1.0 mm硅膠管； h. 長30 cm，內直徑1.0 mm硅膠泵管； i. 等徑直通接頭； j. 魯爾接頭； k. 2個2 L玻璃培養瓶； l. 10% LB培養基（可按需使用其他培養基）； m. 過濾器（過濾孔0.22 μm）； n. 蠕動泵（aperistaltic pump）； o. 所需菌株； p. 醫用尖銳物處理容器； q. 75%酒精； r. 鑷子； s. 5 mL及1 mL無菌針管； t. 無菌針頭； u. 移液器； v. 無菌移液管。 4.2.2.2 培養步驟【附錄以protocol/SOP模式進行詳細闡述】 首先將生物被膜池式培養裝置進行滅菌和組裝，在用藥組的培養基玻璃瓶中加入工作濃度的目標抗生素并混合均勻；在陽性對照組的培養基玻璃瓶中加入已知具有抑菌抑生物被膜濃度的粘菌素colistin并混合均勻；在陰性對照組的培養基玻璃瓶中加入等體積的用藥組抗生素的溶劑并混合均勻。用藥組、陽性對照組和陰性對照組均按照附錄X的培養步驟進行接種、培養（附錄Xf），后收集生物被膜進行觀察。 4.2.2.3 技術要點 a. 所有操作須嚴格遵守無菌操作流程，在操作過程中注意須使用滅菌器具并用酒精消毒操作臺以及所使用的器具，避免交叉污染; b. 使用針管與針頭吸取菌液后，針頭不可朝向操作人，不可蓋回針頭蓋子，以免誤傷操作人員； c. 將使用過的針管與針頭丟棄入醫用尖銳物處理容器統一處理，避免誤傷操作人員； d. 保證無阻泵運行速度一致，避免液體回流造成污染； e. 保證培養池翻轉狀態，以免影響生物被膜形成； f. 黏結培養池與池蓋時須小心不可將池蓋壓破，并須保證培養池與池蓋完全密封，避免菌液與培養基溢出造成污染； g. 保證培養池所有通道暢通，避免堵塞造成液體回流與污染； h. 在培養過程中如需添加培養基，須用酒精消毒瓶口與鄰近裝置表面，避免污染； i. 培養瓶口須用透氣封口膜密封防止培養基蒸發。

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