DNA測序技術的現狀和發展（四）
1.1.3.2 模板制備程序
完全的體外大規模模板制備工作是達成高通量、低價格測序技術的前提。已廣泛使用的乳液PCR擴增技術就是一種很好的方法。不過，由于很難在熱循環測序反應中保證乳液微滴的穩定性，因此最開始實驗的模板擴增方法是恒溫擴增法（isothermal）。
乳液PCR不需要借助細菌的幫助就能擴增模板，雖然這一點非常誘人，但最開始時并沒有合適的表面活性劑能幫助乳液在熱循環過程中保持穩定。于是出現了恒溫擴增法，即滾環擴增反應（RCA）。雖然滾環擴增反應的產量非常高，但這些產物中大部分都不能用來作為測序模板。因此，還需要找到一種不需要細菌擴增，能用于有限稀釋的模板擴增新方法。于是，人們又把目光轉回了PCR法。在RCA法中，首先將模板克隆有限稀釋之后置入光纖玻片上的小孔中，然后用橡膠襯墊把光
纖玻片封閉起來，將玻片放入傳統的平頂PCR儀進行擴增。這種方法取得了成功，但是效率不高，因為在玻片中的熱質量（thermal
mass）和它的鉗效應（clamping
mechanism）需要更長的PCR循環時間，而且模板的有限稀釋度不能低于10%。孔與孔之間的相互污染現象也是一個不容忽視的問題。不過無論如何，該方法還是第一個首先從全基因組文庫中擴增模板然后使用非Sanger、非Gilbert測序法對基因組進行從頭測序的方法，也是第一個使用體外模板擴增
技術進行全基因組（腺病毒基因組）測序的方法。
乳液滴的熱穩定性問題最終通過加入用于制造炸藥的表面活性劑得到了解決，于是乳液PCR技術馬上在眾多新一代測序儀中得到了廣泛的應用。因為乳液 PCR技術具有高效性、可擴展性，既能從30Kb的腺病毒基因組中擴增模板，也能從好幾Mb的肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）基因組中擴增模板。
隨著測序精度、測序長度、乳液滴穩定性等各方面技術的不斷發展，454測序儀已經不僅僅用于對細菌級別的基因組進行測序了，還能對更高級、更復雜的生物基因組進行測序，例如現代人類基因組、尼安德特人基因組以及環境基因組等。
1.1.3.3 文庫制備
文庫制備包括以下幾個步驟，首先隨機切割樣品基因組，獲得大量DNA片段，然后接上接頭進行擴增反應。454測序儀的樣品制備程序和Craig Venter等人的鳥槍法樣品制備程序有著本質的差別。454公司采用的是如圖4中所示的有限稀釋、乳液PCR擴增法，而沒有鳥槍法中的細菌克隆繁殖步驟。去掉了細菌繁殖步驟極大地提高了整個測序工作的速度和效率，同時避免了由于細菌繁殖導致的序列丟失的可能性。這種方法同樣對古老DNA和代謝基因組學的研究也非常適用。末端配對文庫制備方法的建立同樣幫助454測序儀獲得了對復雜基因組從頭測序、對重復片段測序以及對基因組結構（復制、重排）展開系統研究三種能力。這種末端配對文庫的制備方法是受到了Bender科研小組對果蠅（Drosophila）制備跨步文庫（jumping library）方法的啟發而發展得來的。
1.1.4 應用范圍
隨著越來越多重要的研究領域受到測序技術的影響，454公司開始和其它商業和學術機構開展合作，進行樣品測序和分析工作。這些合作項目又進一步驗證 了454測序儀使用的技術能夠在眾多領域中發揮作用，例如末端配對文庫技術對于研究基因組結構的作用和乳液PCR技術捕獲目的DNA片段的作用等。
1.1.4.1 細菌基因組測序和比較基因組研究
為了測試454測序儀在全基因組測序方面的能力，454公司一開始就參與了一項合作項目，該研究項目會對4株結核分支桿菌基因組進行測序，這四株結核分支桿菌分別是一株對R207910具有耐藥性的結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）菌株，基因組大小約4Mb；兩株對R207910具有耐藥性的恥垢分支桿菌（Mycobacterium smegmatis），基因組大小約6Mb；以及一株正常的恥垢分支桿菌（Mycobacterium smegmatis），基因組大小約6Mb。他們希望能發現結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）對R207910產生抗藥性的機制。該項研究清晰的展現了454測序儀在測序速度和測序精度方面的優勢。使用傳統的 Sanger測序法對一個4Mb的基因組和3個6Mb的基因組進行測序需要好幾個月的時間，而用454測序儀，在只有一位實驗人員參與實驗的情況下，包括樣品制備等步驟在內所用的時間僅需要一周。而且使用454測序儀還避免了傳統測序方法中細菌克隆階段可能出現的錯誤，獲得了高質量的測序結果，發現了導致 結核分枝桿菌對R207910產生抗藥性的兩個點突變位點。這項研究成果讓我們在最近的40年內第一次找到了特異性治療結核病的藥物，同時也對454測序 儀在細菌基因組測序方面的應用價值有了深刻的體會。隨后，454測序儀又參與了比較基因組學研究項目、對高致病性細菌空腸彎曲菌 （Campylobacter jejun）基因組的從頭測序項目、對幽門螺桿菌（Helicobacter pylori）在慢性胃炎致病過程中的進化研究項目、從南極海冰細菌（Antarctic sea ice bacterium）中新發現冰結合蛋白（ice-binding protein）并對其測序的研究項目，以及在引起肺炎、腦膜炎和泌尿道感染的細菌中發現致病因素的研究項目等。
由于454測序儀不會因為細菌克隆產生測序誤差，所以在對結核分枝桿菌抗藥性的研究中表現出了非常強的發現突變位點的能力，這一點也被后來的其它研 究項目所證實。此外，最近在用454測序儀進行的人類基因組測序項目中發現了長達29Mb的片段與人類基因組參考序列build-36不相符，這些片段被 認為是參考序列中不存在的序列，屬于基因組中的常染色質部分。不過，還需要注意的是，有些報道稱由于重復片段的存在會出現序列組裝錯誤，而且小模板片段霧化（nebulization）處理這種方式也會造成測序錯誤出現。
1.1.4.2 小RNA測序
對于包括miRNA在內的小RNA的研究興趣從2005年開始就持續不斷升溫，而2005年恰好也是454測序儀上市的那一年。454測序儀以其不 需要進行傳統的細菌克隆步驟和足以覆蓋只有21bp長的miRNA的測序長度等優勢，很快就在miRNA的作用研究之中占據了一席之地。454測序儀最早 參與進行的miRNA研究是對擬南芥（Arabidopsis thaliana）miRNA開展的研究。隨后馬上又參與了另一項研究項目，在這個項目中我們在小鼠體內發現了一種新型的小RNA——piRNA。這些研 究項目為我們在人類、黑猩猩、斑馬魚和腫瘤細胞系中開展小RNA研究鋪平了道路。454測序儀具有的這種對小RNA進行研究的能力使它在眾多有關RNA的 研究領域都能有所作為，例如轉錄體研究領域、EST研究領域、5’-RATE研究領域和基于轉錄體的SNP研究領域等。
1.1.4.3 在古生物學和古DNA研究領域的作用
要用傳統的測序方法對尼安德特人的基因組進行測序研究非常困難，因為這些古老DNA量非常少，而且都早已裂解成了片段。一開始，454公司使用比較 容易得到的不太重要的古代DNA樣品檢驗了454測序儀對它們的測序能力，結果非常好，盡管當時454測序儀的測序長度只有100bp。不過，尼安德特人 的基因組片段長度基本上都介于40bp~90bp之間，而且最近開發的乳液PCR方法也能夠對微量（單分子）樣本進行很好的擴增。于是，454測序儀參與 了對38,000年前古老的尼安德特人的基因組進行測序的工作，研究結果分別發表在了好幾篇論文當中，引起了廣泛的關注，并促進了古生物學基因組的研究。 隨后有人對長毛象（woolly mammoth）和更新世狼（Pleistocene wolves）的基因組開展了測序研究。
1.1.4.4 環境基因組學和感染性疾病研究領域
美國在2001年爆發了炭疽恐怖襲擊危機之后，454公司便對如何使用454測序儀對復雜的、未知的、未人工培養的環境微生物基因組進行測序展開了研究。前后兩個合作研究項目均表明454測序儀能夠用于從DNA混合樣品中發現未知微生物并對其進行分類。在第一個研究項目中，有三名患者都接受了同一名 澳大利亞器官捐贈者的器官，之后均因不明原因而死亡。從這三名死者身上提取了非人類DNA樣品進行測序，結果獲得了144,000條序列。分析后發現，這些序列分別屬于一種沙粒病毒科（Arenaviridae）家族病毒的14個不同基因。隨后進行的第二項研究在對健康蜂群和患病蜂群進行環境基因組學比較研究之后發現，以色列急性麻痹病毒（Israeli acute paralysis virus）是導致蜜蜂蜂群崩潰癥的元兇。上述這些研究都突出了454測序儀的一個特點，即在樣品準備前不需要進行克隆或預擴增步驟，因此非常適用于對未知的未能人工培養的物種進行測序。這些特點也在其它對地下礦藏、深海、土壤和高鹽等環境下進行的環境微生物構成方面的研究所證實。
1.1.4.5 基因組結構研究領域
454測序儀技術的進步使它能夠適用于更多的科研領域。最新開發的末端配對測序法（paired-end sequencing）就非常適合用于發現人類基因組當中的結構變異。末端配對作圖過程（paired-end mapping），簡單來說就是對一個非洲人和一個歐洲人的基因組進行測序后發現結構變異并對其作圖，最終將1,000多個3Kb或更長的結構變異片段定 位到人類基因組參考序列中。研究發現，在人類基因組當中存在的結構變異遠遠超過了人們的預計，其中有很多變異都會造成非常重要的表型改變。這項對諾貝爾獎得主James Watson基因組進行測序的項目和其它相關研究，一起使得“人類基因多樣性（human genetic variation）”這一科學命題成為了《科學》（Science）雜志的年度重大科技突破。
1.2 Illumina測序儀
Illumina測序儀通常也被稱作Solexa測序儀（Illumina測序儀的特點見表5）。它適用于采用各種方法制備的DNA文庫，文庫中DNA片段可以長達數百bp，并可通過橋式PCR來擴增模板片段（圖5b）。在橋式PCR反應中，正向引物和反向引物都被通過一個柔性接頭（flexible linker）固定在固相載體（solid substrate）上。經過PCR反應，所有的模板擴增產物就都被固定到了芯片上固定的位置。
值得注意的是，Illumina測序儀使用的橋式PCR與傳統的橋式PCR有所不同，它會交替使用Bst聚合酶進行延伸反應以及使用甲酰胺 （formamide）進行變性反應。這樣，經過橋式PCR擴增之后，也會在固相載體上形成一個個的模板“克隆”。一塊芯片的8條獨立“泳道”上每一條泳道都可以容納數百萬的模板“克隆”，這樣一次就可以同時對8個不同的文庫進行測序。
經過上述PCR擴增步驟之后，所有的模板都被線性化處理（linearization）而形成單鏈模板，接著與測序引物退火、雜交。隨后使用修飾的 DNA聚合酶和四種核苷酸混合試劑進行單堿基延伸測序反應（圖6b）。這些核苷酸試劑都經過兩種方式處理過，它們都是可逆的終止子（reversible terminator）。這些核苷酸的3’羥基端都有一個可被化學法切除的基團，這樣每一次反應都只會摻入一個核苷酸，同時每種核苷酸都標記上了可被化學 法切除的不同顏色的熒光基團，以標識每種堿基。經過一輪單堿基摻入反應采集到信號之后，就可以通過化學方法切除上述被摻入核苷酸上標記的兩個基團，然后就 能夠繼續摻入下一個核苷酸，重復測序反應了。這種測序方法對36bp長度的序列測序準確率是非常高的，不過如果處理更長的序列，準確率就會有所降低了。
