DNA測序的方法--自動測序法的操作步驟

一、準備工作

1. BigDye測序反應試劑盒 主要試劑是BigDye Mix，內含PEZL四色熒光標記的ddNTP和普通dNTP，AmpliTaq DNA polymerase FS，反應緩沖液等。

2. pGEM-3Zf (+) 雙鏈DNA對照模板 0.2 g/L，試劑盒配套試劑。

3. M13(-21)引物 TGTAAAACGACGGCCAGT，3.2 μmol/L，即3.2 pmol/μl，試劑盒配套試劑。

4. DNA測序模板 可以是PCR產物、單鏈DNA和質粒DNA等。模板濃度應調整在PCR反應時取量1 μl為宜。本實驗測定的質粒DNA，濃度為0.2 g/L，即200 ng/μl。

5. 引物需根據所要測定的DNA片段設計正向或反向引物，配制成3.2 μmol/L，即3.2 pmol/μl。如重組質粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13(-21)引物，T7引物等。

6. 滅菌去離子水或三蒸水。

7. 0.2 ml或和0.5 ml的PCR管 蓋體分離。

8. 3 mol/L 醋酸鈉(pH5.2) 稱取40.8 g NaAc·3H2O溶于70 ml蒸餾水中，冰醋酸調pH至5.2，定容至100 ml，高壓滅菌后分裝。

9. 70%乙醇和無水乙醇。

10. NaAc/乙醇混合液 取37.5 ml無水乙醇和2.5 ml 3 mol/L NaAc混勻，室溫可保存1年。

11. POP 6測序膠 。

12. 模板抑制試劑(TSR) 。

13. 10×電泳緩沖液?。

14. 全自動DNA測序儀。

15. PCR儀。

16. 臺式冷凍高速離心機。

17.?臺式高速離心機或袖珍離心機。

二、PCR測序反應

1. 取0.2 ml的PCR管，用記號筆編號，將管插在顆粒冰中，按下表加試劑：

所加試劑 測定模板管 標準對照管

BigDye Mix 1 μl 1 μl

待測的質粒DNA 1 μl －

pGEM-3Zf (+) 雙鏈DNA － 1 μl

待測DNA的正向引物 1 μl －

M13(-21)引物 － 1 μl

滅菌去離子水?2 μl 2 μl

總反應體積5 μl，不加輕礦物油或石蠟油，蓋緊PCR管，用手指彈管混勻，稍離心。

2. 將PCR管置于9600或2400型PCR儀上進行擴增。98℃變性2 min后進行PCR循環，PCR循環參數為96℃ 10 s，50℃ 5 s，60℃4 min，25個循環，擴增結束后設置4℃保溫。

三、醋酸鈉/乙醇法純化PCR產物

1. 將混合物離心，將擴增產物轉移到1.5 ml EP管中。

2. 加入25 μl醋酸鈉/乙醇混合液，充分振蕩，置冰上10 min以沉淀DNA。12 000 r/min于4℃離心30 min，小心棄上清。

3. 加70%(V/V)的乙醇50 μl洗滌沉淀2次。12 000 r/min于4℃離心5 min，小心棄上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀10～15 min。

四、電泳前測序PCR產物的處理

1. 加入12 μl的TSR于離心管中，劇烈振蕩，讓其充分溶解DNA沉淀，稍離心。

2. 將溶液轉移至蓋體分離的0.2 ml PCR管中，稍離心。

3. 在PCR儀上進行熱變性(95℃ 2 min)，冰中驟冷，待上機。

五、上機操作

1. 按儀器操作說明書安裝毛細管，進行毛細管位置的校正，人工手動灌膠和建立運行的測序順序文件。

2. 儀器將自動灌膠至毛細管，1.2 kV預電泳5 min，按編程次序自動進樣，再預電泳(1.2 kV，20 min)，在7.5 kV下電泳2 h。

3. 電泳結束后儀器會自動清洗，灌膠，進下一樣品，預電泳和電泳。

4. 每一個樣品電泳總時間為2.5 h。

5. 電泳結束后儀器會自動分析或打印出彩色測序圖譜。

六、序列分析

儀器將自動進行序列分析，并可根據用戶要求進行序列比較。如測序序列已知，可通過序列比較以星號標出差異堿基處，提高工作效率。

七、儀器清洗

測序完畢按儀器操作規程進行儀器清洗與保養。

八、計算

1. 測序反應精確度計算公式：100%－差異堿基數(不包括N數)/650×100%。

2. 差異堿基即測定的DNA序列與已知標準DNA序列比較不同的堿基，N為儀器不能辨讀的堿基。