在微流控平臺下高通量研究3D神經網絡的形態特征（一）
介紹：
建立生理學上模擬體內環境的體外模型對了解神經系統疾病機制和藥物研發具有至關重要的作用。干細胞誘導的神經細胞培養在3D環境下，對于化合物篩選和疾病模型建立有較大的潛力。3D培養被認為是最接近人體組織的體外培養方法，無論是結構、細胞生長特點及細胞與細胞和細胞與基質之間的相互作用，都很好的模擬了體內環境。本篇說明介紹了一個新的神經退行性疾病和神經毒性篩選的方法，應用iPSC誘導的神經細胞在OrganoPlate?高通量微流控平臺上進行3D水平上的神經突觸檢OrganoPlate?是一個結合了最新3D培養技術和微流控技術的高通量篩選平臺，基于96孔組織芯片，可以做長時間活細胞檢測，滿足篩選需要，并且兼容常用實驗室設備和自動化系統，如ImageXpress? MicroConfocal高內涵成像和分析系統。
材料：
? OrganoPlate? 板 (MIMETAS)
? 人iPSC誘導的神經細胞iCell? Neurons(Cellular Dynamics International)
? 神經細胞培養基(Cellular DynamicsInternational)
? Matrigel (Corning)
? Calcein AM (Life Technologies)
? MitoTracker Orange(Life Technologies)
? Hoechst (Life Technologies)
? Saponin (Sigma)
? PBS (Sigma)
? Αντι-β-tubulin III (TUJ-1) 抗體(BDBiosciences)
? ImageXpress Micro Confocal 共聚焦高內涵成像和分析系統 (MolecularDevices)
? MetaXpress高內涵成像和分析軟件6.2(Molecular Devices)
在3D膠中形成神經網絡：
細胞培養、化合物處理和細胞染色步驟依照微流控操作說明。對3D膠中神經細胞的表型變化和細胞活力的評價采用共聚焦成像模式。人iPSC誘導的神經細胞與Matrigel膠混合，膠的終濃度為7mg/mL，并以30,000細胞每微孔槽的濃度加入OrganoPlate?板中。在種板的時候，膠和細胞的混懸液需放置于冰上以防止Matrigel膠凝固。根據膠的濃度和細胞濃度調整加入一個微流控孔道中的體積在1-1.4μL之間。種板后，將微流控板放置于37°C 5% CO2的培養箱中孵育30分鐘，使膠凝固。然后，向微流控通道的入口和出口分別加入50μL培養基，再放入培養箱中。24小時后形成神經突觸，可一直培養至14天。為評估OrganoPlate微流控板研究神經毒性和神經元發育的可行性，選取了幾種已知的神經突觸抑制劑處理神經元。細胞在培養24小時后加入化合物，繼續培養5天，并每兩天更換一次含有化合物的培養基，并且化合物以合適的梯度加入微流控孔中。神經網絡的形成通過透射光進行實時監測，為評價神經細胞活力向細胞中加入三種活細胞染料的混合液：活細胞染料鈣黃綠素(1μM)，線粒體膜電位染MitoTrackerOrange(1 μM)，和細胞核染料Hoechst(1μM)。混合染料被加入微流控芯片孔道中，孵育60分鐘后用培養基洗掉。或者，細胞被4%多聚甲醛固定后加入0.01%皂素進行細胞膜通透，用1:100稀釋的神經元標記物β-tubulin III (TUJ-1)一抗和熒光二抗染色，Hoechst染細胞核。一抗孵育需要4°C過夜。
3D培養的表型分析：
高內涵成像和分析系統被用于評價化合物對神經網絡的影響。為更好的研究3D膠中的神經細胞活力和突觸生長，我們優化了共聚焦成像模式和分析方法。神經細胞圖像由ImageXpress Micro Confocal共聚焦高內涵系統獲取，采用了10x、20x和40x物鏡，并在聚焦面的上下拍攝一個Z軸序列(圖1)。17-30層，層間距為3-10μm的圖像被采集，包含大約150-300μm厚度。所有圖片被保存，并被用于進一步的3D分析和2D透射分析(Maximum透射或BestFocus)。
3D培養的表型分析：
高內涵成像和分析系統被用于評價化合物對神經網絡的影響。為更好的研究3D膠中的神經細胞活力和突觸生長，我們優化了共聚焦成像模式和分析方法。神經細胞圖像由ImageXpress Micro Confocal共聚焦高內涵系統獲取，采用了10x、20x和40x物鏡，并在聚焦面的上下拍攝一個Z軸序列(圖1)。17-30層，層間距為3-10μm的圖像被采集，包含大約150-300μm厚度。所有圖片被保存，并被用于進一步的3D分析和2D透射分析(Maximum透射或BestFocus)。
Maximum透射2D圖像分析：
應用MetaXpress?高內涵圖像采集和分析軟件進行圖像分析。全自動的對圖像進行定量分析使用的兩種方法：做透射后進行2D分析和Z-stack的3D水平分析。對2D透射圖像分析， Z - s t a c k 序列圖像進行Maximum透射，然后用軟件預置的神經突觸分析模塊進行分析。輸出的評價不同時間點細胞表型及神經網絡復雜程度的參數包括：突觸總長度、突觸個數、細胞數和細胞活力。透射光的圖像用Best Focus算法進行2D透射后進行分析。2D圖像的分析速度快，可精確的評價神經網絡的程度。但是，2D分析有一定的局限性，這種方法無法計算如體積這樣的參數，并且得到的只是單層的結果。圖2和3所示為熒光合成圖，對照組和魚藤酮處理組圖片被神經突觸模塊分析后的mask圖片。分析參數包括：突觸總長度、突觸個數和細胞總個數(細胞體)。圖4顯示了神經突觸長度、突觸個數和細胞活力的隨化合物的處理而減少，神經毒性化合物包括：磷酸三苯酯、四乙基秋蘭姆、六氯酚、魚藤酮和甲基汞(均為10μM)。
